注射用微球内部无菌检查法探讨.docx

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1、随着制药工业的发展，为适应疾病的治疗或预防需要而采用的药物剂型层出不穷12.药物与适宜载体(生物可降解材料)经过一定的分散包埋技术制得的微米或纳米级固态、液态或气态药物，包括微囊、微球、微晶、脂质体和纳米粒等，称为微粒制剂，其中注射用微球是应用最广泛的微粒制剂之一.从国家药品监督管理局网站上可查询到30余个注射用微球的进口、国产品种的批准文号，代表性品种有注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球、注射用醋酸奥曲肽微球、注射用全氟丁烷微球等。这些品种的质量控制和分析方法备受关注，其中无菌检查法的科学性和合理性是其关注的重要内容。关于微粒制剂的质量控制,美国药典(USP42)欧洲药典(EPI1o)

2、、日本药典(JP18)等均未单独收载通用性技术要求的章节，仅在制剂通则中对处方设计和制备工艺进行了介绍性说明，未涉及微生物检查方法的特殊规定；美国注射剂协会(PDA)技术报告、人用药品技术要求国际协调理事会(ICH)指导原则中也未涉及相关规范性要求;中华人民共和国药典2010年版(ChP2010)附录首次收载微球、微囊和脂质体制剂指导原则，ChP2015修订为微粒制剂指导原则(通则9014),一直沿用至ChP2023。通则9014中对于药物载体类型、常用辅料载体和质量控制的检查项目等进行了规定，但未对微生物质量控制提出明确的技术要求3。目前，注射用微球品种标准中无菌项下规定主要分为3类。指向通

3、则，未规定具体操作方法，如：取本品，加所附的助悬剂制成混悬液，依照无菌检查法进行检查，应符合规定。指向通则，规定了具体操作方法，如：取本品，每支按说明书，用所附的注射器和针头，加入所附的溶剂使分散均匀，采用直接接种法，取每支全量接种至培养基50m1中，以金黄色葡萄球菌为阳性对照，依照无菌检查法进行检查，应符合规定。规定分别进行微球内部和外部的无菌性检查，如：取本品，分别溶解于相应培养基2m1中，过滤，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，进行外部无菌检查；取本品，分别溶解于无菌二甲基亚碉(DMSO)2m1中，过滤，且每膜过滤体积不超过10m1,以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，进行内部无菌检查。注射用微球

4、无菌检查的难点聚焦在“球内无菌”，即微球内部的无菌性检查4。一般而言，产品采用终端灭菌工艺，且粒度分布小于微生物污染物，生产工艺过程中微生物不易存在或不易存在于制剂内部的，进行微球外部无菌性检查；产品采用无菌生产工艺，但粒度分布大于或类似于微生物污染物，在生产过程可能存在潜在污染风险时，应分别进行微球内部和外部的无菌性检查。经调研，大部分注射用微球采用无菌生产工艺，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(P1GA)作为辅料56,与原料混合后，在密闭系统中包裹形成制剂，生产过程涉及二氯甲烷、乙酸等有机溶剂7,这种条件不利于微生物的生长和存活，但存在耐受性芽泡的污染风险。代表性品种(如注射用醋酸奥曲肽微球等)在

5、进行微球内部无菌检查时，采用DMSO作为溶剂制备供试液，但高浓度DMSo具有抑菌作用，是否影响无菌检查方法的适用性和有效性尚待评估。此外，在某些品种(如注射用利培酮微球)的方法建立过程中，曾对其生产工艺各环节进行风险评估，认为涉及的无菌操作均在微球硬化之后，潜在的污染物仅可能存在于外表面，故在标准变更时取消了内部无菌检查。上述评估的规范性如何在药品标准中进行通用性技术规定，尚未进行深入探讨。本研究选择注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球、注射用醋酸奥曲肽微球等国内外代表性品种，聚焦微球内部的无菌性检查，考察供试液制备、试验用菌株、检查方法等关键技术环节的科学性和合理性，以期为注射用微球无菌

6、检查方法的建立和药品标准的制定和修订提供研究思路和数据支撑。Part仪器与试药PhenomNano型扫描电镜(荷兰Phenom公司)；Supro150型溅射仪里纳科学仪器(上海)有限公司；MIR254型恒温培养箱(日本PanaSOniC公司)；FoM4/9型高压蒸汽灭菌器(意大利FCdCgari公司)；SteritestEquinox型集菌仪和Mi11if1eX型薄膜过滤系统均购自德国Merck-Mi11ipore公司。注射用醋酸亮丙瑞林微球(上海丽珠制药有限公司)、注射用利培酮微球(瑞士Janssen-Ci1ag公司)、注射用奥曲肽微球(瑞士NovartisPharmaSchweiz公司)和

7、注射用全氟丁烷微球(美国GEHea1thCareAS公司)，上述产品均在有效期内。硫乙醇酸盐流体(FTM)培养基(批号VM859391903)、胰酪大豆豚液体(TSB)培养基(批号VM884759920)和胰酪大豆月东琼脂(TSA)培养基(批号VM873358915)均购于德国MerckMi11ipore公司；沙氏葡萄糖液体(SDB)培养基(英国OXOid公司，批号2202463)；沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基(批号1086835)和pH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液(批号1086984)均购于广东环凯微生物科技有限公司；01%无菌蛋白陈水溶液(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号20230

8、812)；DMSO(国药集团化学试剂有限公司，批号20131225)；其他试剂均为分析纯，水为灭菌纯化水。金黄色葡萄球菌(StaPhyIOeOCCUSaureus)CMCC(B)26003大肠埃希菌(ESChCriChiaco1i)CMCC(B)44102S铜绿假单胞菌(PSeUdomonaSaeruginosa)CMCC(B)10104枯草芽电杆菌(Baci11ussubti1is)CMCC(B)63501、短小芽胞杆菌(Baci11usPUmi1US)CMCC(B)63202、生袍梭菌(CIOStridiUmSPOrOgenCS)CMCC(B)64941、白念珠菌(Candidaa1bic

9、ans)CMCC(F)98001黑曲霉(ASPCrgiIIUSniger)CMCC(F)98003等无菌检查用标准菌株均为本实验室保藏。Part方法与结果1.1 1试验菌液的制备参照ChP2023无菌检查法(通则I1O1),制备大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、白念珠菌、黑曲霉和生抱梭菌的试验菌液；参照ChP2023抗生素微生物检定法(通则1201),制备枯草芽也杆菌芽抱和短小芽抱杆菌芽泡的试验菌液。分别用PH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液制成每1m1含菌数为108cfu和不大于100cfu的菌悬液。供试液的制备DMSO供试液：取注射用微球粉末(装量约为每瓶30mg),每

10、瓶加入DMSO溶液2m1,混匀。另取样品，分别加入10%DMS0、25%DMS0、50%DMS0、75%DMSO溶液，均无法溶解形成均一的供试液。根据ChP2023通则1101关于供试液接种比例不大于培养基体积10%的规定，后续试验中分别采用100%DMSO（高浓度）、10%DMSO溶液（低浓度），考察溶剂对试验菌生长的影响。水溶性供试液：精密称取氯化核2.7g,置50On11量瓶中，用水450InI溶解，量取三乙胺6.0m1加入瓶中，混匀，用水定容，用三乙胺调至PH1O.00.1,制成PH1o.0缓冲液，灭菌8。取注射用微球粉末（装量约为每瓶30mg）,转移至含上述灭菌缓冲液25InI的玻璃

11、瓶中，密封，置45C、120r/min的恒温摇床，至微球完全溶解。方法适用性试验参照ChP2023无菌检查法（通则I1（H）配制相应培养基，经培养基的适用性和灵敏度检查，符合药典标准规定。方法适用性试验的设置共分为3组，其中空白对照组用于判定试验方法体系是否正常，溶剂组用于判定溶剂对试验方法是否有干扰，试验组用于判定试验方法是否符合规定。试验组：取注射用微球，加入相应溶剂（DMSo或PH10.0缓冲液），在上述溶液中分别加入含菌量不大于100cfu的试验菌液，混匀；将含有大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和生泡梭菌的混合溶液转移至FTM培养基50m1中，于33C培养不少于5d,将含有枯草

12、芽抱杆菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽抱杆菌芽抱和短小芽抱杆菌芽抱的混合溶液转移至TSB培养基50m1中，于23培养不少于5c1,观察试验菌是否生长。溶剂对照组：取相应溶剂（DMSO或PH10.0缓冲液），加入含菌量不大于IOOCfU的试验菌液，混匀，其他同试验组操作。空白对照组：取灭菌纯化水，加入含菌量不大于100cfu的试验菌液，混匀，其他同试验组操作。注射用微球的形态考察分别取少量注射用微球，用小药勺取出少许粉体或粉块，均匀撤至石英玻璃台上，使用一次性刻刀，反复、随机刻切10次；将上述粉体或粉块均匀撒至样品台导电胶上，使用洗耳球轻吹样品表面，清理未黏附牢固的样品，采用溅射仪（设置溅射功率20

13、W,镀金时间30s）处理,然后装载入扫描电镜（SEM）仪,根据不同的成像比例，设置加速电压为5或IOkV。分别以注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球和注射用醋酸奥曲肽微球为考察对象A一注射用醋酸亮丙瑞林微球（X2000,加速电压5kV,比例尺30um）：B-注射用利培酮微球（X2000倍，加速电压5kV,比例尺30um）：C一注射用醋酸奥曲肽微球（X2000倍,加速电压IOkV,比例尺301Im）；D一注射用醋酸亮丙瑞林微球（剖面图,X5000倍,加速电压IokV,比例尺10Un1）；E一注射用利培酮微球（剖面图，X6800倍，加速电压5kV,比例尺10urn）；F一注射用醋酸奥曲肽微球（

14、剖面图，X2000倍，加速电压10kV,比例尺30m）0图1注射用微球代表性品种的SEM照片结果显示，3种微球均为实心球体，球面直径为30IOOm；其中注射用醋酸亮丙瑞林微球为蜂窝状实心球体，球体内孔径为13Um,球面和球内的直径均在微米级，与常见细菌的大小处于同数量级。虽然P1GA是缓释或控释制剂的常用辅料6,具有生物可降解性，但在无菌检查供试液的常规制备时间内无法完全溶解。DMSO溶解微球后的无菌检查方法适用性试验2.2.1 DMSO对试验菌生长抑制作用考察分别取“2.2”项下100%DMSO（高浓度）、10%DMSO溶液（低浓度）适量,依照ChP2023通则1101,分别加入不大于IOO

15、CfU的各试验菌悬液，混匀。将含有大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和生抱梭菌的混合溶液转移至FTM培养基50m1中，于33培养不少于5d,将含有枯草芽抱杆菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽也杆菌芽抱和短小芽抱杆菌芽胞的混合溶液转移至TSB培养基50InI中，于23C培养不少于5d。结果如表1所示，100%DMSO具有抑菌作用，药典规定的试验菌（营养体）均无法生长；枯草芽也杆菌芽抱和短小芽胞杆菌芽也可以生长。10%DMSO溶液无抑菌作用，ChP2023规定的试验菌（营养体）和耐受性芽抱均可以生长，但微球无法溶解。注：D每个单元格有5个正负号，依次显示试验菌接种后d1至d5的生长情况：“-”表示

16、无菌生长，“+”表示有菌生长。表1DMSO对试验菌生长的抑制作用1）2. 5.2方法适用性试验分别选择注射用醋酸亮丙瑞林微球和注射用利培酮微球2个代表性品种,进行微球内部无菌检查的方法适用性试验。取上述样品，每瓶用DMSo溶液2m1溶解微球，以此作为供试液。供试液冷冻干燥后镜检，结果显示SEM视野下未见完整的微球形态，提示辅料已被DMSO溶液溶解。依照ChP2023通则1101,在注射用微球与DMSO溶液混合后，分别加入不大于100cfu的各试验菌悬液，混匀。将含有大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和生也梭菌的混合溶液转移至FTM培养基50m1中，于33C培养不少于5d,将含有枯草芽胞杆菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽抱杆菌芽抱和短小芽抱杆菌芽抱的混合溶液转移至T