新冠核酸检测扩增检测操作规程（中元）.docx

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1、S0P_18-40 新型冠状病毒2019-nCoV基因（中元）扩增检测操作规程1 .名称新型冠状病毒（2019-nCoV） RN2 .目的规范新型冠状病毒（2019-nCoV） RNA荧光定性PCR项Fl检测试验，确保检测结果的准确性和重复性。3 .方法TaqMan探针实时荧光定性。4 .检测原理本试剂盒采用RNA逆转录反应以及聚合酶链式反应（PCR）结合Taqman技术，根据病毒的核酸序列设计特异性的引物用于扩增对应的核酸片段，同时，高度特异性的TaqMan探针可与对应的核酸片段进行结合，并在TaqS外切酶活性作用下发生水解，产生荧光信号,根据荧光信号与扩增循环数之间的关系可得到实时扩增曲线

2、。本试剂盒中以2019-nCoV的ORFlab基因，N基因为检测对象，从而实现对2019-nCoV核酸的检测。5 .样品口咽拭子、鼻咽拭子、痰液等6 .试剂重庆中元汇吉生物技术有限公司序号成分主要组分32人份12019-nCoV PCR 反应液PCR缓冲液、Mg 2+离子、dNTPs引物、探针256 Ll 管22019-nCoV 酶液逆转录酶、Taq酶、UNG酶64Ll 管32019-nCoV阴性对照品生理盐水800 Ll 管42019-nCoV阳性对照品含目的扩增片段的假病毒800 Ll 管52019-nCoV 内标含内标片段的假病毒32Ll 管注：不同批号的组分不可以互换使用。酶在使用前应

3、低速离心数秒，以收集管壁或管盖残留成分。其它组分使用前应在室温下融解，旋涡震荡数秒，充分混匀，低速离心数秒后使用。7.仪器苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量PCR仪。8 .操作步骤9 . 1PCR试剂准备（I区）8. 1.1从试剂盒中取出2019-NC0VPCR反应液、2019-NCOV酶液、内标，室温融化后振荡混匀，8,000rpm离心数秒后使用。8. 1. 2取N个（N=待测样本个数十阴性对照品+阳性对照品）PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将10ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR反应液的PCR管置I区区传递窗。NC单人

4、份扩增体系配制如下表：2019-NC0VPCR反应液2019-NC0V 酶液扩增体系8ul2ul10ul8. 1.3试剂准备区清洁:每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。9. 2核酸模板提取（II区）核酸提取:取200ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。10. 3加样（区）在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性对照品、待测标本核酸、阳性对照品各10ul,盖紧管盖，8,00（kpm离心数秒后，置区III区传递窗。标本制

5、备区清洁：每次完成试验操作后，医疗垃圾用2000mgL含氯消毒剂喷洒至完全湿润，用鹅颈式封扎，带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。11. PCR扩增检测（I区）8 . 4. 1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。9 . 4. 2循环参数设定：序号步骤温度时间循环数1UXG酶反应371分钟循环1次2逆转录505分钟循环1次3预变性952分钟循环1次4变性955秒循环45次退火、延伸及检测荧光6030秒8. 4. 3样品设置在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。10 基线

6、和阈值设定基线通常按照仪器自动设置的基线即可。基线调整原则：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点（Start）避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（End）比最早出现指数扩增的样本Ct/Cq值减少1-2个循环。阈值设定原则为阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。11 .质控标准10. 1阴性对照品：靶标通道（FAM、ROX） Ct=45或无数值，同时内标（VIC） Ct40o10. 2阳性对照品：靶标通道（FAM、R0X）同时满足：扩增曲线呈典型S型，且Ct值40。10. 3应同时满足上述2项条件，否则试验无效。10.4每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性

7、质控样本（2份生理盐水和1份阴性对照品）。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，3个阴性质控全部测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因，必要时重新检测样本。1L结果判断在质控品正常的情况下，结果判断如下:结果判断标准阳性FAM和ROX通道同时满足：扩增出线呈典型S型，且Ct值V40,提示2019-nCoV病毒为阳性。其中FAM通道代表N基因，ROX代表ORF lab基因检测结果。阴性FAM、ROX荧光通道均无Ct或者Ct值等于45,同时VIC通道Ct40,提示2019-nCoV病毒为阴性。灰区FAM或ROX有1个为阳性，或40Ct45,同时VIC通

8、道Ct40,提示结果处于灰区，需复测。如复测结果中FAM或ROX有1个通道Ct45,且呈典型扩增曲线，则判断为阳性，否则为阴性。无效FAM, ROX荧光通道Ct=45或无数值，同时VIC通道Ct40或无数值，提示结果无效，需重复实验。【检验方法的局限性】（1）、本试剂检测结果应结合其他相关医学检查结果进行综合分析，不单独作为诊断依据。（2）、不合理的样本采集、转运、储存；不当的试验操作；不合适的实验室环境均有可能导致假阳性或假阴性结果。12.性能指标（厂家提供）12.1 阴/阳性参考品符合率:检测国家参考品中的阳性参考品，或经标化的企业阳性参考品,阳性符合率100%；检测国家参考品中的阴性参考

9、品，或经标化的企业阴性参考品，阴性符合率100%o1.1 2最低检出限：本试剂盒最低检测限为200copiesmL01.3 3精密度:Ct值变异系数（CV, %） SARS、MERS、H1N1 （新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒）、H3N2、H5Nk H7N9,乙型流感Yamagata、Victoria,呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C组，腺病毒1、2、3、4 5、7 55型，肠道病毒A、B、C、D组，人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌、百日

10、咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、烟曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、人类基因组DNA等无交叉反应。1.5 5干扰试验：在潜在最大浓度下，正常人血液、粘蛋白、鼻腔喷雾剂或滴鼻剂（羟甲喋林、苯福林、氯化钠）、鼻用皮肤类固醇（地塞米松、倍氯美松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松）、盐酸组胺、抗病毒药物（。-干扰素、奥斯他韦、孔那米韦、利巴韦林、帕拉米韦、洛匹那韦、利托那韦、阿比多尔）、抗生素（左氧氟沙星、头抱曲松、阿奇霉素、美罗培南）、妥布霉素对检测结果未见显著影响。1.6 6临床评价：在4家临床机构完成789例临床样

11、本测试，与己上市同类产品相比，阳性符合率98.99%,阴性符合率98. 58%,总符合率98.73%。13 .生物参考区间阴性。14 .干扰反应（或污染源）14.1 样本之间污染。14.2 试剂、耗材（如Tip头）、设备（移液器、离心机、扩增仪等）污染。14 . 3产物及其他质粒污染。15 .安全防护措施具体请参见我科新冠核酸检测质量与安全管理手册、生物安全管理手册。16 .临床意义体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的咽拭子、痰液样本中、新型冠状病毒（2019-nCoV）ORFlab和N基因。该产品仅用于2019年12月

12、以来，新型冠状病毒（2019-nCoV）感染的肺炎疫情期间，相关病例的辅助诊断和此次疫情的体外诊断应急储备，不能作为常规体外诊断试剂应用于临床。在使用上应当遵守新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案、新型冠状病毒感染的肺炎防控方案等文件的相关要求。17 .相关文件17. 1新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）产品说明书。17. 2全国临床检验操作规程（第4版）。17.3 新冠核酸检测质量与安全管理手册17.4 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法17.5 医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明（CNAS）17.6 生物安全管理手册18.相关记录18. 1 YCXZYYJYK-JL-S01L18-17-01 附表 16 可接受标本记录表18.3 YCXZYY/JYK-JL-SOP 18-17-02 附表 17 拒收标本记录表18.4 YCXZYY/JYK-JL-S01L18-35-01 附表 21 PCR 实验室流程图