显微镜的使用和革兰氏染色法.docx

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1、一般光学显微镜的使用及革兰氏染色法摘要：微生物的最显著特征就是个体微小，一般必需借助显微镜才能观看到它们的个体形态和细胞结构。熟识显微镜和把握其操作技术是讨论微生物不行缺少的手段。革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法，可以区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。本试验只要是学习并把握油镜的使用及革兰氏染色的方法和步骤，巩固平板划线分别法及无菌操作技术。关键词：显微镜油镜革兰氏染色法1前言L1试验目的1 .学习并把握一般光学显微镜及油镜的原理和使用方法。2 .把握采用显微镜观看不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌等在光学显微镜下的基本形态特征。3 .学习细菌染色的原理和方法。4 .把握细菌的简洁染色法

2、和革兰氏染色法。5 .巩固平板划线分别法及无菌操作技术。1. 2试验原理1. 2.1显微镜的使用在一般显微镜（图1）通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物讨论最为重要，与其它物镜相比，油镜的使用方法比较特别，需要在载玻片和物镜间加滴镜油（通常用香柏油），这主要有以下两方面的缘由：增加照光明度从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同，有些光线会因折射或全反射不能进入镜头，致使摄入光线较少，物象显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时必需在油镜和玻片之间加入与玻璃的折射率（n=L55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率n=1.52）.光线通过载玻片可直接通过香柏油进入

3、物镜而几乎不发生折射（接物镜油浸系），使视野增加进光量,这样就能使物像更加清楚。详见图2增加显微镜的辨别率图1图21.2.2革兰氏染色法简洁染色法是采用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般外形和细菌排列的观看。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C. Gram所创立的。革兰氏染色法可将全部的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最终用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；假如细胞中初

4、染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和组成的差异所打算的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色2材料与方法2.1 材料2.1.1 菌种大肠杆菌牛肉膏蛋白陈琼脂斜面培育物，金黄色葡萄球菌牛肉膏蛋白陈琼脂

5、斜面培育物，枯草杆菌牛肉膏蛋白陈琼脂斜面培育物。2.1. 2溶液和试剂香柏油，二甲苯，革兰氏染液，草酸镀结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等。2.1.3仪器和其他用品酒精灯，载玻片，一般光学显微镜，擦镜纸，接种环，试管架，镣子，载玻片夹子，载玻片支架，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。2. 2方法与步骤简洁染色试验步骤步骤内容备注1涂片：取一块载玻片，滴一滴储水于波片中心，用接种环以无菌操作从大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹;滴蒸储水和取菌不宜过多;涂片要涂匀称，不宜过厚。2干燥：在酒精灯火焰上方文火烘干。不要离得太近，以免杀死细菌。3固定：手执玻片

6、一端，让菌膜朝上，通过火焰23次固定（以不烫手为宜）。目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之坚固附着在载玻片上。4染色：滴加一滴结晶紫染液于涂片上，染色1.5分钟。染液刚好掩盖涂片薄膜为宜5水洗：用水洗去涂片上的染色液。不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急。6干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。7镜检：详细步骤见2. 2. 2。涂片必需完全干燥后才能用油镜观看。2. 2. 2显微镜的操作步骤步骤内容1显微镜的安置：置显微镜于平整的试验台上，镜座距试验台边缘约10cm,。镜检时态度要端正。2调整光源：将聚光器提升至最高位置，同时通过调整光源灯的电压获得适当的

7、照明强度。3低倍镜观看：将要观看的装片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推动器使观看对象处于物镜的最下方。下降10X物镜，使其接近标本，用粗调整器渐渐升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调整器调整至物像清楚。4高倍镜观看：眼睛离开目镜从侧面观看，旋转物镜转换器，将高倍镜转至正下方，留意避开镜头与玻片相撞。再由目镜观看，认真调整光圈，使光线的光明度相宜。用细调整器校正焦距使物镜清楚为止。将最相宜观看部位移至视野中心。不要移动装片位置，预备用油镜观看。5油镜观看：在高倍镜下找到合适的观看目标并将其移至视野中心，将高倍镜转离工作位置，在待观看的样品区域滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置，油镜镜头

8、此时应正好浸泡在镜油中。调整照明使视野的亮度合适，微调细调整器使物像清楚。6镜检完毕后的处理升镜筒，取下载玻片。用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上参加的油迹，最终再用洁净的擦镜纸擦去残余的二甲苯。2.2.3革兰氏染色试验步骤步骤内容备注1制片：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环依次取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及待测细菌四种菌体，涂在载玻片上，使其薄而匀称。然后让涂片在空气中自然干燥，最终让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定。固定时不行过热，以不烫手为宜，以免破坏细胞形态。2初染：滴加草酸钱结晶紫染液掩盖涂菌部位，染色L5min后倾去染液，水洗至流出水无色。3媒染

9、：先用碘液冲去残留水迹，再用碘液覆lmin,倾去碘液，水洗至流出水无色。4脱色：将玻片上的水迹用吸水纸擦干，用滴管滴加95%乙醇脱色30 s,马上用水洗去乙醇。乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。5复染：将玻片上的水迹用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min,水洗，吸取残水晾干。在染色的过程中，不行使染液干枯。6镜检：油镜观看。3结果与分析2.1 简洁染色的试验结果经简洁染色的大肠杆菌呈现紫色，细菌形态为杆状。如图3所示。2.2 革兰氏染色的试验结果（见下表，附图）革兰氏染色后试验结果菌种菌体颜色细菌形态结果(G+ , G-)大肠杆菌红色杆状G-金黄色葡萄球菌蓝紫色球状G+枯草芽抱杆菌蓝紫色杆状

10、，比大肠杆菌稍长G+待测菌种蓝紫色球状G+图3简洁染色后的大肠杆菌图5革兰氏染色后的金黄色葡萄球菌图4革兰氏染色后的大肠杆菌图6革兰氏染色后的枯草杆菌图7革兰氏染色后的自选细菌3. 3结果分析依据革兰氏染色的原理以及观看到的细菌的染色状况可以知道，大肠杆菌被染成红色，为革兰氏阴性菌；金黄色葡萄球菌和枯草芽泡杆菌被染成蓝紫色，为革兰氏阳性菌；自选的待测菌种经革兰氏染色后呈现蓝紫色，可知该菌种为革兰氏阳性菌。3. 4思索题L油镜观看时应留意的问题：在使用油镜之前，必需先经低、高倍镜观看，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心；需观看部位的玻片上滴加一滴香柏油，在转换油镜时，从侧面水平凝视镜头与玻片

11、的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片为宜。油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦洁净。在载玻片和镜头之间加入香柏油的作用：增加照光明度增加显微镜的辨别率。2 .什么是物镜同焦现象？它在显微镜观看中有什么意义？在一般状况下，当物像在一种物镜中已清楚聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观看时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦(parfocal) o采用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调整器即可对物像清楚聚焦，从而避开由于使用粗调整器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。3 .影响

12、显微镜辨别率的因素：最小可辨别距离=入/2nsin0 (人为光源光波波长，n为介质折射率，。为物镜镜口角的半数，即取决于物镜的直径和工作距离)4 .革兰氏染色胜利需留意的问题：肯定要选处于活跃期的菌种染色，老龄的革兰氏阳性菌会被染成红色造成假阴性。涂片不宜过厚，以免脱色不完全。掌握好脱色时间，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。5 .当用革兰氏染色法对某些菌染色时，假如这种菌本身能够与结晶紫结合的足够紧密,就可以省去媒染的步骤。假如不需要观看革兰氏阴性菌的形态特征，可省略复染的步骤，此时显微镜下的革兰氏阴性菌无色。6 .老龄的革兰氏阳性菌会被染成红色造成假阴性，这是由于若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。7 .为什么肺部组织未被染上蓝紫色？由于肺部组织细胞没有细胞壁，虽然细胞膜也可附着结晶紫燃料，但在脱色是很简洁被洗掉，故不能染色。参考文献L沈萍 陈向东.微生物试验M.4版.高等训练出版社,2007.40-44及81-84页