目的基因双酶切和电泳纯化胶回收实验报告.docx

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1、题目：目的基因双酶切和电泳纯化胶回收一.实验目的:1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法；2. 练习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。3. 学习核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。二.实验原理1限制性核酸内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。2.切割序列：(1)BamHI切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5,-GIGATCC3,-5GGATCC3,3,CCTAGtG5-3,CCTAGG5(2)EcoR1切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5,-GIAATTC3,5,GAATTC3,3,

2、-CTTAAtG5,3,CTTAAG53 .为什么要选择表达载体质粒pET-28a?PET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。目的基因被克隆到PET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。宿主菌带有受IaCUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过IPTG来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。4 .限制性内切酶的选择：选择BamH1、NOt1两个位点由于实验中须将质粒pEGFP-N3上所需的目的基因切下并连接到载体质粒pET-28a上，所以选择的限制酶需满

3、足以下几个要求：一.选择两种在质粒pEGFP-N3和载体质粒pET-28a上都有酶切位点的限制性酶切酶，以保证切下的目的基因和载体质粒分别都有两个不同的末端，这样可以防止：(1)质粒和目的基因的自身环化；(2)质粒与质粒、目的基因与目的基因相互自身连接；(3)质粒与目的基因反向连接)二.两种限制性内切酶的酶切位点需满足：(1)不破坏目的基因；(2)在质粒pEGFP-N3和载体质粒pET-28a上都有且只有一个酶切位点；(3)在载体质粒上的切割位点距离尽量短些，并且不破坏载体质粒的启动子等关键序列。载体质粒pET-28a和质粒pEGFP-N3的酶切位点示意图:图一、pET-28a的酶切位点示意图

4、图二、质粒pEGFP-N3的酶切位点示意图61162101储I65161|671EGFP4pM础IXcm1I1,sp1201Xma1Sac11Sma1CAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCG6GCCCGGGATCCATCGCCACCATGGTG的川Xfto1A1dE1R1PSHSM1r11iAcc1Ed136I1图三、pEGFP-N3MCS多酶切位点示意图5 .琼脂糖凝胶回收（1）在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些小片段，这些小片段可能会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片段的最好方法就是进行琼脂糖凝胶电泳；（2）不

5、同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中由于泳动速度不一样而分离，通过回收可用于后续实验；（3）本次实验使用试剂盒进行胶回收，按说明书进行操作，可以用溶剂使琼脂糖融化，再经过吸附管吸附目标DNA,冲洗，溶解后得到高纯度的目的基因片段。(4)硅胶树脂在高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA,通过离心可将DNA片段沉淀下来，在碱性低盐浓度下其与DNA的结合能力会急剧降低，使用弱碱溶液如TE(pH8.0)等可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段；三.实验材料及设备1 .实验材料：己经提取好的pEGFP-N3质粒，1.5m1塑料离心管若干，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿(如三角瓶、量筒

6、、试剂瓶等)，锥形瓶，一次性手套2 .实验仪器：(1)恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、IOOOU1取液器各一支，移液枪头若干，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；(2)电泳仪，电泳槽，样品槽模板(梳子)，有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。3 .实验试剂：(1)目的基因的双酶切a.核酸外切酶：NotIBanIH1酶(置于冰盒中)b.IOXbuffer(withBSA),ddH20（2） DNA琼脂糖凝胶电泳检测与纯化a. geneGreen（DNA染料）b. IXTAE缓冲液c.上样缓冲液（61OadingBuffer）（3）胶回收目的基因片段a.胶回收试剂盒一套，

7、ddH20四.实验方法及步骤1 .目的基因双酶切a）分别取两支02m1EP管做上记号：如；b）两个EP管中分别配置下列的20（老师提供）30u1（自提）体系：（本次实验使用20U1体系）EP管EP管IOxbuffer(withBSA)21/31+31ddH2O10buffer(withBSA)2131+31ddH2ONotI11NotI11BamHI2121BamHI2121pET-28a151/201pEGFP-N3151/201C）将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37度酶切1h；d）酶切体系（20U1+411oadingBuffer/301+6U11oadingBuffer）全部

8、加入点样孔进行电泳（自行配制40m11%电泳凝胶液做胶），MarkerDNA加51,电泳结束后对目的基因片段进行胶回收。切胶前请先称量装胶的15m1离心管重量并做记录，标记好离心管，装胶后在进行称量，算出胶的重量；e）切胶时，带好护目镜。在紫外线灯照射下清晰可见目的基因片段,亮度较高，边际清晰，回收得到含有目的基因片段的琼脂胶，称重。f）按照回收试剂盒步骤切胶回收所需目的基因片段；g）将提取好的目的基因上交保存；2 .DNA琼脂糖凝胶电泳检测a）琼脂糖凝胶板的制备b）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入3011XTAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解；c）待胶液冷却到65度（不烫手为宜）,加

9、入IU1Genegreen混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内，静置30min左右，轻轻晃动拔出梳子；3 .加样酶切体系（201+4U11oadingBuffer/301+611oadingBuffer）全部加入点样孔进行电泳（自行配制4011%电泳凝胶液做胶故MarkerDNA加514 .电泳将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为IOOV左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约12cm处，停止电泳。5 .观察和拍照将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。五.实验结果p

10、ET-28aMarkerA带：15000bpB带IOOOObpC带7500bpD带5000bpE带3000bpF带IOOObpG带250bp图1双酶切体系处理pEGFP-N3与pET-28a质粒凝胶电泳紫外荧光检测结果说明：从左到右依次为：pET-28a、PEGFP-N3、D115000MakerPEGFP-N3、D115000Maker由图可知，pEGFP-N3泳道呈现为十分清晰的双条带，上部为酶切后的pEGFP-N3质粒，下部为目的基因片段，无拖影，无杂带，说明目的基因纯度较高，数量较多，前一实验提取的质粒纯度较高。与Marker比照，酶切理论上会产生约4000bp和约800bp的条带，预

11、期分子量基本符合对应的分子量条带，实验结果较好。pET-28a泳道共产生了四条条带，除了最上层清晰的5000bp条带，还应该出现30bp的条带，但该条带由于分子量太小，很有可能已经脱出琼脂胶，无法在结果上显示，所以另外的三个条带推测为前一次实验提纯质粒时混入的RNA或其他杂质。切胶时，带好护目镜。在紫外线灯照射下清晰可见目的基因片段，亮度较高，边际清晰，回收得到含有目的基因片段的琼脂胶，称重结果为约11g。胶回收完成后，得到少量溶有目的基因片段的PE管一支。六.结果讨论与结论：1 .实验结论：根据琼脂糖电泳紫外荧光检测结果可见，各泳道拖影现象不明显，pEGFP-N3泳道条带清晰，无扭曲现象，无

12、杂带，酶切结果较好；pET-28a泳道由于只是切开一个缺口，理论上只应该有一个清晰条带，实验结果符合预期。和Marker对照分子量符合理论结果，实验结果良好，可继续用于下一次实验。2 .讨论一：影响酶切效率的因素有哪些？答：DNA的质量，限制性内切酶活性，酶的用量，酶切时间，酶切温度，缓冲液的条件3 .讨论二：在实验操作中，取用酶试剂时操作应注意哪些方面？答：(1)放在冰上使用，让酶一直处于低温环境，保持活性；(2)取用不同的酶时要换新枪头，不要污染酶试剂。4 .讨论三：实验操作中，怎样能使微量的试剂混合均匀？答：(1)加入试剂时，尽量在管底部加入；(2)可进行瞬时离心。5 .讨论四：本次实验

13、酶切结果较好，可能是哪些原因？答：(1)在酶切之前，轻柔混匀酶与质粒多次，加快反应，提高效率；(2)适当延长酶切的时间，保证反应的完成度。(3)前一次提取的质粒数量和质量较高,提高了本次实验的成功率。6 .讨论五：胶回收时的注意事项？(1)检测时用小梳子，减少损耗(2)回收提纯时用大梳子，提高效率(3)称取胶的重量，是为了确定PC溶液的质量，避免浪费和其他不可预知的影响。(4)用平衡液处理吸附柱，直接影响后续的实验结果，因为回收柱的盐浓度、酸碱度(电荷)和疏水性使对DNA与柱子结合有着决定性的作用；衡液B1的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性，消除高温、潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响；如果胶回收的吸附柱没用平衡液B1进行处理，吸附柱的吸附能力就不高，就会降低回收DNA的效率。七.参考文献：1魏群.分子生物学实验指导（第三版）2朱玉贤，李毅，郑晓峰，郭红卫.现代分子生物学（第4版）.高等教育出版社.2013,1