第十单元免疫缺陷性疾病的免疫学检测-PPT.pptx

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1、第十单元免疫缺陷性疾病的免疫学检测获得性免疫缺陷综合征获得性免疫缺陷综合征 就是由人类免疫缺陷病毒就是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起得以感染所引起得以CD4+T细胞减少为主要特征细胞减少为主要特征,同时伴反复机会感染、同时伴反复机会感染、恶性肿瘤及中枢神经系统退行性病变得一组综合征。恶性肿瘤及中枢神经系统退行性病变得一组综合征。HIV感染得免疫学检验方法主要针对病毒抗原与抗病毒抗感染得免疫学检验方法主要针对病毒抗原与抗病毒抗体得检测以及免疫细胞数量与功能得分析。体得检测以及免疫细胞数量与功能得分析。HIV抗体初筛实验主要包括酶联免疫吸附试验抗体初筛实验主要包括酶联免疫吸附试验(ELIS

2、A)、化学发光或免疫荧光试验、快速检测试验化学发光或免疫荧光试验、快速检测试验(明胶颗粒凝集明胶颗粒凝集试验、免疫渗滤试验与免疫层析试验试验、免疫渗滤试验与免疫层析试验)等。等。ELISA就是最常用得就是最常用得HIV抗体初筛实验方法。本实验采用抗体初筛实验方法。本实验采用双抗原夹心双抗原夹心ELISA法检测人血清中法检测人血清中HIV抗体。抗体。检测方法检测方法 在符合在符合级生物安全实验室级生物安全实验室(BSL-2)要求得艾要求得艾滋病检测实验室中进行。滋病检测实验室中进行。实验条件实验条件 将将HIV抗原包被于固相载体抗原包被于固相载体,加入待检样品与酶标记加入待检样品与酶标记得得HI

3、V抗原抗原,形成抗原抗体酶标抗原复合物形成抗原抗体酶标抗原复合物,洗涤洗涤,加底加底物显色。通过酶标仪检测吸光度物显色。通过酶标仪检测吸光度A450nm 值值,根据根据A450nm 值判断值判断HIV抗体得存在与否。抗体得存在与否。实验原理实验原理1、HIV抗原酶标板。抗原酶标板。2、洗涤液洗涤液 PBS-Tween20。3、辣根过氧化物酶标记得辣根过氧化物酶标记得HIV抗原。抗原。4、辣根过氧化物酶底物溶液。辣根过氧化物酶底物溶液。5、底物稀释液底物稀释液 PBS-1%BSA。6、终止液终止液 2mol/l H2SO4溶液。溶液。7、对照血清对照血清 临床标本筛选获得得阳性血清与阴性血清。临

4、床标本筛选获得得阳性血清与阴性血清。8、酶标仪、洗板机。酶标仪、洗板机。试剂与器材试剂与器材操作步骤操作步骤编号:将样品对应微孔按序编号将样品对应微孔按序编号,每板设阴性对照每板设阴性对照2孔、孔、阳性对照阳性对照3孔孔,空白对照空白对照2孔孔加样:分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照 100l,用封板膜封板后置用封板膜封板后置37温育温育60min。洗涤:用洗板机清洗用洗板机清洗,在干净滤纸上拍干。在干净滤纸上拍干。加酶:每孔加酶结合物每孔加酶结合物100l(空白对照孔除外空白对照孔除外),充分充分 混匀混匀,置置37温育温育30min。洗涤:用洗

5、板机清洗用洗板机清洗,在干净滤纸上拍干。在干净滤纸上拍干。显色:每孔加入底物缓冲液每孔加入底物缓冲液50l,TMB 50l,振荡混振荡混 匀匀,37避光显色避光显色10min。测定:每孔加终止液每孔加终止液50l,振荡混匀。在振荡混匀。在450nm波长波长 下下,酶标仪测定各孔酶标仪测定各孔A450nm值。值。结果判断结果判断计算临界值计算临界值:临界值临界值=阳性对照值阳性对照值10%。正常情况下正常情况下,阳性对照孔得阳性对照孔得A450nm值值0、80,样品样品A450nm值值临界值者为临界值者为HIV抗体阳性。抗体阳性。正常情况下正常情况下,阴性对照孔得阴性对照孔得A450nm值值0、

6、08,样品样品A450nm值值临界值者为临界值者为HIV抗体阴性。抗体阴性。注意事项注意事项实验中设立阳性与阴性对照。实验中设立阳性与阴性对照。底物显色时间不宜过长。底物显色时间不宜过长。注意生物安全。注意生物安全。对初筛呈阳性反应得样品对初筛呈阳性反应得样品,应进行复检试验。如复检均呈应进行复检试验。如复检均呈阴性阴性,则报告则报告HIV抗体阴性抗体阴性(-);如均呈阳性反应如均呈阳性反应,或一阴一阳或一阴一阳,应送应送HIV确证实验室进行确证试验。确证实验室进行确证试验。临床意义临床意义作为作为HIV感染得筛查实验。感染得筛查实验。HIV有两个血清型有两个血清型:HIV-1与与HIV-2,

7、后者少见。此试验阳性者应进一步作确证试验。后者少见。此试验阳性者应进一步作确证试验。思考题思考题ELISA就是检测就是检测HIV抗体得常用方法抗体得常用方法,但并不就是唯一得方法。但并不就是唯一得方法。化学发光或免疫荧光试验、免疫胶体金以及免疫层析实验等化学发光或免疫荧光试验、免疫胶体金以及免疫层析实验等均可用于均可用于HIV抗体得检测抗体得检测,试比较各种方法之间得优缺点。试比较各种方法之间得优缺点。第三军医大学第三军医大学 吴超吴超 实验二实验二 HIV确认实验确认实验HIV抗体初筛试验阳性者抗体初筛试验阳性者,须作确证试验。确证实验必须须作确证试验。确证实验必须在专门得艾滋病确证实验室中

8、进行在专门得艾滋病确证实验室中进行,并最终确定患者就是并最终确定患者就是否感染否感染HIV。确证试验方法包括免疫印迹试验、条带免疫试验、放射确证试验方法包括免疫印迹试验、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验、免疫荧光试验等。免疫沉淀试验、免疫荧光试验等。免疫印迹实验免疫印迹实验(Western Blot,WB)就是用以检测就是用以检测HIV抗体抗体得首选确证试验方法得首选确证试验方法,其检测结果常常被作为鉴别其她检其检测结果常常被作为鉴别其她检验方法优劣得验方法优劣得“金标准金标准”。以硝酸纤维素膜为载体得抗原条以硝酸纤维素膜为载体得抗原条,组合了组合了HIV-1全病毒抗全病毒抗原与原与HIV-2

9、gp36重组蛋白抗原。当抗原条与被检血清及重组蛋白抗原。当抗原条与被检血清及对照血清接触时对照血清接触时,如血清标本有如血清标本有HIV-1/HIV-2特异性抗体特异性抗体,将会与抗原条上得将会与抗原条上得HIV-1/HIV-2 gp36抗原结合。结合得抗原结合。结合得抗体再与酶标二抗结合抗体再与酶标二抗结合,加入底物显色加入底物显色,观察结果判断。观察结果判断。实验原理实验原理1、HIV1/2抗原硝酸纤维膜条抗原硝酸纤维膜条 20条条2、印迹缓冲液印迹缓冲液(10)12ml3、漂洗缓冲液漂洗缓冲液(10)60ml4、底物底物BCIP/NBT溶液溶液 50ml5、结合物结合物 70l6、HIV

10、1/2阴性对照血清阴性对照血清 70l7、HIV1弱阳性对照血清弱阳性对照血清 70l8、HIV1强阳性对照血清强阳性对照血清 70l9、反应槽、摇床、移液管、吸引器反应槽、摇床、移液管、吸引器试剂与器材试剂与器材操作步骤操作步骤1.取出反应槽取出反应槽,每一槽内加每一槽内加2ml漂洗缓冲液。漂洗缓冲液。2.用镊子小心地夹住抗原条编号端放入漂洗缓冲液中用镊子小心地夹住抗原条编号端放入漂洗缓冲液中,编编号面朝上号面朝上,每槽每槽1条条,让溶液让溶液完全覆盖。完全覆盖。3.将反应槽放将反应槽放置摇床置摇床,摇动摇动510分钟后吸弃漂洗液。分钟后吸弃漂洗液。4.每槽加入印迹缓冲液每槽加入印迹缓冲液2

11、ml,然后分别加入然后分别加入20l待检血清待检血清或血浆或血浆,并用本试剂盒中得对照血清作平行对照并用本试剂盒中得对照血清作平行对照。6.在室温下将反应槽在摇床上摇动在室温下将反应槽在摇床上摇动60分钟。分钟。旋摇完毕后旋摇完毕后,吸弃印迹缓冲液吸弃印迹缓冲液。7.每槽加入每槽加入2ml漂洗缓冲液漂洗缓冲液,旋摇旋摇5分钟后分钟后,吸弃漂洗缓冲吸弃漂洗缓冲液液,共漂洗共漂洗3次次,每次每次5分钟。分钟。8.在每槽中加入在每槽中加入2ml结合物稀释液结合物稀释液,旋摇旋摇45分钟。分钟。9.从槽中吸弃结合物稀释液从槽中吸弃结合物稀释液,重复步骤重复步骤6。10.每槽中加入底物每槽中加入底物2m

12、l,旋摇旋摇15分钟。分钟。11.吸去底物液吸去底物液,每槽中加入每槽中加入2ml蒸馏水蒸馏水,旋摇旋摇5分钟分钟 后后,终止反应终止反应。将抗原条放于二张滤纸间吸干水分后观察。将抗原条放于二张滤纸间吸干水分后观察结果。结果。结果判断结果判断1、对照血清检测结果判定要求对照血清检测结果判定要求 HIV-1强阳性对照血清强阳性对照血清:必需出现必需出现gp160/gp120与与gp41、p24带型带型,以及以及p66、p55/p51、p34、p17带型判定为阳带型判定为阳性性,HIV-2 gp36应为阴性。应为阴性。HIV-1弱阳性对照血清弱阳性对照血清:在在gp160、gp120与与gp41、

13、p24带带型中至少出现二条型中至少出现二条,判定为阳性。其她位置其可能出现判定为阳性。其她位置其可能出现弱带弱带,但对分析并非必需。但对分析并非必需。HIV-2 gp36应为阴性。应为阴性。HIV-2阳性对照血清阳性对照血清:必需出现必需出现gp36重组蛋白带型。重组蛋白带型。阴性对照血清阴性对照血清:应无上述得特异性带型出现。应无上述得特异性带型出现。2、被检血清被检血清/血浆得判定标准血浆得判定标准有下列情况之一者判定为有下列情况之一者判定为HIV-1抗体阳性。抗体阳性。至少一条至少一条env带与一条带与一条pol带带;至少一条至少一条env带与一条带与一条gag带带;至少一条至少一条en

14、v带、一条带、一条gag带与一条带与一条pol带带;至少二条至少二条env带带;有有HIV-2 gp36重组蛋白带型出现者判定为重组蛋白带型出现者判定为HIV-2抗体阳性抗体阳性,需用需用HIV2确认试剂进一步检测。确认试剂进一步检测。无无HIV抗体特异性带型出现者判定为抗体特异性带型出现者判定为HIV抗体阴性。抗体阴性。出现出现HIV特异性抗体带型特异性抗体带型,但带型不足以确认阳性者但带型不足以确认阳性者,判定判定为为HIV抗体可疑。抗体可疑。注意事项注意事项1.实验实验中必须同时设定中必须同时设定HIV-1强阳性、强阳性、HIV-1弱阳性与弱阳性与HIV-1+2阴性血清对照。阴性血清对照

15、。2.如果抗原条与血清样品作用时间过长如果抗原条与血清样品作用时间过长,阴性样品也可能出阴性样品也可能出现弱带。现弱带。3.凡溶血、脂血或混浊样品均为不宜检测标本。凡溶血、脂血或混浊样品均为不宜检测标本。4.试验中操作应注意生物安全。试验中操作应注意生物安全。5.底物显色时间底物显色时间,一般控制在一般控制在30分钟内。时间太长分钟内。时间太长,本底变深本底变深;如果强阳性血清色带增深时可提前终止反应如果强阳性血清色带增深时可提前终止反应;若弱阳性对若弱阳性对照血清色带较浅照血清色带较浅,可以适当延长反应时间。可以适当延长反应时间。临床意义临床意义 用于在初筛试剂判断为用于在初筛试剂判断为HI

16、V阳性阳性(如如ELISA法法)基基础上得血清或血浆样本础上得血清或血浆样本,进行确证就是否为进行确证就是否为HIV-1阳阳性及诊断就是否感染了性及诊断就是否感染了HIV-2。思考题思考题1.HIV血清抗体检测得初筛实验与确认实验在检测血清抗体检测得初筛实验与确认实验在检测HIV感感染得临床意义及实验原理上得差异？染得临床意义及实验原理上得差异？2.免疫印记实验、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验及免疫印记实验、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验及免疫荧光试验免疫荧光试验(IFA)等均可用作等均可用作HIV得确认实验得确认实验,试分析试分析免疫印记实验应用如此广泛得原因免疫印记实验应用如此广泛得原因?第三军医大学第三军医大学 吴超吴超 实验三实验三 T细胞亚群得流式细胞仪检测细胞亚群得流式细胞仪检测 HIV感染可导致免疫系统中感染可导致免疫系统中CD4+T细胞数量减少以细胞数量减少以及及CD4+T细胞细胞/CD8+T细胞比例失调细胞比例失调,因此因此,CD4+T细胞计细胞计数可用于评价数可用于评价HIV感染者免疫状况感染者免疫状况,辅助临床进行疾病分辅助临床进行疾病分期。期。CD4+T淋巴细胞