全二维与一维气相色谱质谱联用技术解析苏派黄酒挥发性组分.docx

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1、全二维与一维气相色谱质谱联用技术解析苏派黄酒挥发性组分中国黄酒与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒，是一种以稻米等为原料、以曲为发酵剂酿造而成的低度发酵酒，采用“用曲制酒、双边发酵”的酿造工艺1,组分复杂且风味独特。黄酒产区分布广泛，由于原料曲种、生产工艺和酿造环境等因素的影响，各产区的黄酒均有其独特的风味特征。苏派黄酒产自江苏南部地区，是黄酒的主要产区之一，产品风格以清爽型为主，具有“酒色橙黄，清澈透明，醇香清雅，柔和清爽”的风格特点，与其他产区黄酒差异明显。目前针对不同产区黄酒的风味研究已逐步展开2,利用现代仪器分析技术解析黄酒中的挥发性组分种类及含量，有助于明晰不同产区黄酒的香气组成及风味特征

2、。传统的一维气相色谱-质谱联用技术(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)是黄酒香气分析最常用的工具，近年来研究人员常采用顶空固相微萃(headspacesolid-phasemicroextraction,HS-SPME)结合GC-MS技术对黄酒挥发性组分进行定性分析，然而受到一维GC-MS峰容量和分辨率的限制，检测时会出现化合物共流出现象，这导致其鉴定的黄酒挥发性化合物往往低于100种3-5o全二维气相色谱-飞行时间质谱(comprehensivetwo-dimensionalgaschromatography-timeofflightmasss

3、pectrometry,GCGC-TOFMS)相对于一维GC-MS具有高分辨率、高灵敏度和高峰容量等优势6-7,第一维色谱柱的所有组分都在第二维色谱柱上进行了正交分离,能够解决一维GC-MS检测时化合物共流出导致的峰掩盖问题。近年来采用GCGC-T0FMS技术对酒类进行风味解析逐渐成为研究热点，而目前其在黄酒领域应用较少，陈双8首次采用GCGC-T0FMS技术对黄酒挥发性组分进行解析，共检测出975个色谱峰；ZHOU等9对黄酒GCGC-TOFMS检测条件进行了优化，并在浙派黄酒中鉴定出267种挥发性化合物。GCGC-TOFMS在挥发性组分的定性分析时展现了其独特的优势，然而一维GC-MS在进行

4、已知化合物的外标法定量分析时仍是简便而有效的工具2,10-12。为探明挥发性组分中的关键呈香物质，GC-MS定量分析结合香气活度值(odoractivityvalue,0AV)法是风味化学领域中鉴定关键香气物质的常用手段，0AV的含义为待测香气化合物与其香气阈值的比值，其值大小可一定程度上反映该化合物对整体香气的贡献程度，常以0AV1作为关键香气物质的判定标准13-15o因此，本研究采用HS-SPME-GCGC-TOFMS技术对苏派黄酒的挥发性组分进行定性分析，并结合HS-SPME-GC-MS定量分析及0AV法鉴定苏派黄酒中的关键香气物质。本研究通过解析苏派黄酒的挥发性组分特征，为中国黄酒风味

5、化学理论体系提供了基础数据，同时为风味导向的苏派黄酒品质控制提供了理论支持。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1实验样品本研究所用苏派黄酒样品由中国江苏地区某公司提供，包括4款半干型和2款半甜型商品酒，样品具体信息如表1所示。表1苏派黄酒样品信息Table1InformationofJiangsuHuangjiusamplesLL2主要试剂C7-C30正构烷烧、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、2-羟基-4-甲基-戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、异戊醛、苯甲醛、己醛、癸醛、苯乙醛、正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、

6、正己醇、苯甲醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、2-辛醇、丁酸、异戊酸、己酸、辛酸、4-乙烯基愈创木酚、愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木2,5-酚、4-乙基苯酚、糠醛、5-甲基吠喃醛、丙位壬内酯、二甲基毗嗪、2-乙基瞰嗪、二甲基三硫（色谱纯）,美国Sigma-Aldrich公司；氯化钠乳酸、乙醇（分析纯）,中国国药上海化学试剂公司。L2仪器与设备PegasusGCTRT4D+全二维气相色谱-高分辨飞行时间质谱仪,美国LECO公司；PALRTC自动进样系统及孵化炉和加热搅拌模块，瑞士CTCanalyticsAG公司；ThermoTracel300-ISQ气相色谱-质谱联用仪、TR-FFAP色谱柱（30m

7、X0.25mmID,0.25m).TG-WAXMS色谱柱(30mX025mmID,0.25m),美国ThermoFisher公司；50/30mDVB/CAR/PDMS三项萃取头,美国Supelco公司；Rxi-17silMS色谱柱(hnX0.25mmID,0.25m),美国Restek公司;手动固相微萃取进样器，德国Gerstel公司；Mili-Q型超纯水仪，美国Millipore公司；DFT01S型恒温搅拌水浴锅，郑州科泰实验设备有限公司;ME204TE型分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司。1.3实验方法1.3.1HS-SPME-GCGC-TOFMS技术解析黄酒挥发性组分1.3.

8、1.1HS-SPME-GCGC-TOFMS前处理方法参照文献16方法进行。取3mL黄酒样品与3mL超纯水于15mL顶空瓶中，加入3gNaCl后迅速盖上瓶盖。样品平衡15min,吸附30min,萃取温度50,不分流进样，解析时间5min0由PALRTC系统自动进样，每个样品相同条件下进样3次。1.3.1.2GCGC-TOFMS仪器条件GCGC条件：一维色谱柱TR-FFAP,二维色谱柱Rxi-17silMSo进样口温度250,不分流进样。起始温度4(C,保持2min,以5oCmin的速率升温至23(C保持7mino调制器调制时间4s,热脉冲时间1.2s。二维柱温箱的温度全程比一维柱温箱高5T。以高

9、纯氨气作为载气，恒流模式。流量：lmLminoTOFMS条件：采用EI离子源，温度28(C,电离能量70eV,传输线温度240,检测器电压1400eV,采集质量数范围(mz)为33400amu,采集频率100spectrumso1.3.2HS-SPME-GC-MS技术定量分析黄酒香气化合物1.3.2.1HS-SPME-GC-MS前处理方法取2mL黄酒样品与4mL超纯水于15mL顶空瓶中，加入2gNaCl充分摇匀，加入10L2-辛醇溶液(10L8mgL),放入转子并盖上瓶盖。将老化好的SPME萃取头通过瓶盖隔垫插入样品萃取瓶的顶空，推出纤维头，使其暴露于萃取瓶的顶空中,放入5(C恒温水浴中萃取5

10、0min,磁力搅拌速度200rmin,每次萃取要使纤维头与提取液液面保持相同的高度。标准曲线绘制：准确称取一定质量的各香气化合物标准品，并用黄酒模拟液(pH4.0,酒精度15%vol)稀释得到一系列不同浓度梯度的混合标准溶液，与样品相同进样，根据目标物与内标物的峰面积比值和浓度绘制标准曲线。1. 3.2.2HS-SPME-GC-MS仪器条件GC条件:毛细管色谱柱TG-WAXMS。载气为高纯氨气(99.999%),流速1.0mLmin,进样口温度250oCo升温程序：初始温度40保持2min,以5Cmin升温至230C,并保持lOmin。MS条件：EI离子源，温度28(C,电离能量70eV,传输

11、线温度240。质量扫描范围33350am1.4数据分析1. 4.1GCGC-TOFMS数据分析由LECO公司Pegasus4D工作站进行数据采集，在ChormaTOF软件平台上进行数据分析，自动识别相似度700的色谱峰后进行自动积分解卷积和谱库比对。使用MicrosoftExcel筛选信噪比(SN)50与不含卤素及硅元素的化合物后通过保留指数(由相同条件下C7C30计算得出)定性。1.4. 2GC-MS数据分析数据由ThermoTraceFinderGC软件进行采集及定量分析。2结果与分析2. 1HS-SPME-GCGC-TOFMS解析苏派黄酒挥发性组分黄酒作为一种发酵酒,使用传统一维气相色谱

12、质谱分析其挥发性组分时容易出现化合物共流出现象，分辨率低、灵敏度低和峰容量低等缺点影响了黄酒挥发性化合物的鉴定效果,无法满足科研工对黄酒风味解析的需求。而全二维气相色谱-飞行时间质谱技术在一维气相色谱分离的基础上进一步使用不同性质色谱柱进行第二次分离，大大减少了一维色谱峰掩映的问题，同时结合飞行时间质谱技术可以有效提高分析的分辨率和灵敏度，适用于诸多复杂酒精饮料体系的挥发性组分鉴定17-19。a维；b-二维图1苏派黄酒HS-SPME-GCGC-TOFMS分析总离子流色谱图Fig.lAnalyticaltotalionchromatogramcontourobtainedfromtheHS-SP

13、ME-GCGC-TOFMSanalysisofJiangsuHuangjiu使用HS-SPME-GCGC-TOFMS分析苏派黄酒挥发性组分，以其中一款苏派黄酒全二维色谱图为例，图l-a与图1-b分别为苏派黄酒一维与二维总离子流图，在图1-b中每一个黑点代表仪器识别出的一个色谱峰，在该样品中共识别出了818个色谱峰，表明苏派黄酒挥发性组分复杂，由图kb可以看出存在许多一维保留时间相同、二维保留时间不同的化合物,说明苏派黄酒在一维总离子流图中存在化合物共流出现象（图l-a）o各苏派黄酒样品在一维气相色谱中均出现化合物共流出现象，而通过二维短色谱柱进一步分离，在一维长色谱柱上共流出的物质分离效果良好

14、，说明GCGC-T0FMS适用于黄酒体系挥发性组分的鉴定。GCGC-TOFMS在苏派黄酒中共鉴定出了432种挥发性化合物（表2）,其中酯类、醇类、醛类和芳香族化合物占总数的50%以上，分别鉴定出87、47、47和45种。酯类物质数目最多，占挥发性化合物总数量的20.1%,这与浙派黄酒研究报道一致，而与即墨黄酒不同，说明不同产区黄酒的挥发性组分有一定差异。醇类物质是酒精饮料中重要的挥发性化合物，对黄酒风味轮廓和舒适度等具有重要影响。碳原子数大于2的醇类在饮料酒行业通常被称为高级醇，有研究认为其含量高容易造成头疼和深醉，生产过程中应注意其含量控制。黄酒高级醇主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇等

15、9。苏派黄?中醇类物质占总挥发性化合物数量的10.9%,苯乙醇呈玫瑰花香8,1-辛烯-3-醇具有蘑菇香气8,正己醇具有植物生青的香气特征16等，它们对黄酒的香气具有一定贡献,同时也是黄酒中酯类化合物的重要前体。表2苏派黄酒HS-SPME-GCGC-TOFMS鉴定出的挥发性化合Table2QualitativevolatilecompoundsofJiangsuHuangjiubyHS-SPME-GCGC-TOFMS注：1芳香族化合物不包括醇、醛、酮、酸、酯等其他类别物质中包含苯环的化合物；2其他包括缩醛类、醛类、烯煌、杂环类等化合物酮类物质通常感官阈值较低，可能对黄酒的香气具有一定的贡献。苏派黄酒中共鉴定出80个醛、酮类物质，占总量的18.5%o鉴定出的醛类化合物以脂肪醛类为主，苯甲醛具