MDCK细胞培养技术操作规范.docx

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1、MDCK细胞培养技术操作规范(-)生物安全级别和生物安全规定1. MDCK细胞培养实验室生物安全级别：正常MDCK细胞培养在生物安全二级实验室进行。2. MDeK细胞培养实验室生物安全规定：遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。(二)MDCK细胞的传代培养步骤1 .细胞培养所需的材料(部分试剂在此列出生产厂家货号仅供参考，可自行选择)：(1) 生长成片的MDCK细胞；(2) T-75细胞培养瓶,颈口有倾角；(3) D-MEM培养液；(4) 青、链霉素母液(10,000Um1青霉素G；10,000gm1硫酸链霉素)，分装后保存于-20；(5) HEPES缓冲液，IM母液；(6) 胎牛血清；(7)

2、 EDTA-胰酶(0.05%胰酶；0.53mMEDTA4Na)(GibcoCatNo.25300-062),分装后保存于-20C；(8) 牛血清白蛋白组分V,7.5%溶液(GIBCOCatNo.15260)；(9) Im1和IOm1无菌移液管等;(10) 70%75%的酒精。建议：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。2 .培养基和试剂的准备：(1) 50Om1的D-MEM液中加入a)青、链霉素母液5m1(终浓度达:100U/m1青霉素和100gm1链霉素)；b) HEPES缓冲液12.5m1(终浓度:25mM)；c) 7.5%牛血清白蛋白组分V12.5m10d) 加入7.5%NaHC

3、310-15m1(终浓度：2-3%)(2) 细胞生长液IOm1胎牛血清加到90m1的上述D-MEM液，使胎牛血清的终浓度为10%。每批胎牛血清均应进行血清测试，通过测试确定血清的最佳使用浓度。此处提到的血清使用浓度只是一个参考浓度。(3) MDCK细胞的传代培养程序此处以T-75细胞瓶单层培养为例，进行叙述。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的浓度必须做相应的调整。用于细胞培养的培养基、EDTA一胰酶等，置37预热后，用70%75%酒精擦拭后放于生物安全柜内。(1)弃去细胞已生长成片的细胞培养瓶中的培养液，加5m137预热的EDTA-胰酶;(2)温和地摇动细胞瓶Imin,使EDTA-胰酶均

4、匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA-胰酶；(3)重新加入5m137预热的EDTA-胰酶，重复上述步骤；(4)力口Im1EDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37孵育细胞瓶直至细胞从细胞瓶的塑料表面分离(约5min10min)o必要时可以摇动或吹打来分离细胞。加入Im1胎牛血清中和残余胰酶的活性；(5)力9m1细胞生长液，轻轻移动移液管吹散细胞团，吹打从培养瓶底部一边开始到另一边结束，确保所有底部均被吹打到，吹打时动作要轻柔，尽量避免出现泡沫；(6)吹打后，瓶中加入90m1细胞生长液(细胞悬液的浓度约为每m1含细胞)，该培养液含终浓度为10%的胎牛血清；(7)每个T-25细胞培养

5、瓶中加6m1(6x105m1细胞)细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到另一T-75细胞瓶以用于细胞传代的种子。通常6m1细胞悬液23日可长成80%90%的单层细胞片；(8)于37C5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态。注：细胞传代的比例可根据细胞生长状况和实验需要进行调节。消化液除EDTA-胰酶外，也可以用0.25%胰酶与VerSene按照1:7的比例配成消化液使用。(三)细胞的冻存1 .细胞冻存材料(1) 成片的MDCK细胞：80%90%成片，细胞生长良好存活率高；(2) 二甲基亚碉(DMSO)；(3)胎牛血清；(4) EDTA-胰酶(0.05%胰酶；0.53mMEDTA4Na);(5)

6、 无菌移液管：Im1和Iom1。(6) 15m1无菌离心管2 .细胞冻存步骤(1) 冻存液的制备：胎牛血清9m1；二甲基亚飒Im1。(2)细胞消化：消化过程同细胞培养的消化过程。(3)细胞消化后，移入15m1离心管，IOOOrpm,离心5min,弃上清，轻弹离心管底，重悬细胞，加入配制好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。细胞冻存浓度为1x1()6m1细胞。(4)常规细胞冻存过程：42h,-20oC2h,放入液氮长期保存。如使用商品化冻存盒，直接放于-80过夜，第二天从冻存盒取出，放入液氮保存。(四)细胞的复苏复苏细胞的原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死亡。新

7、复苏的细胞一般需要数日或继续传代12代，其细胞生长或细胞特性才会恢复正常。1 .材料(1) 37恒温水浴箱；(2)细胞生长液；(3) 胎牛血清Im1；(4) T-25培养瓶，无菌移液管；(5) 70%75%的酒精；(6) 15m1无菌离心管2 .细胞复苏步骤(1)将细胞生长液放入37水浴预热，预热后以70%75%的酒精擦拭外壁，放入生物安全柜内；(2)自液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，避免热胀冷缩过程盖子松掉；(3)立即放入37水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在Imin内全部融化，以70%75%的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜内；在解冻过程中，需做好个人防护，防止冻存管爆裂；(4)取出

8、1Om1解冻的细胞悬液，缓慢加入到预先加有5m1细胞生长液的15m1离心管内，IOOOrpm,离心5min,弃去上清，用5m1细胞生长液重悬细胞，移入细胞培养瓶内，放入375%Co2培养箱培养。（五）质量控制MDCK细胞随着传代次数的增加，可能会降低其对流感病毒的敏感性。因此实验室应保持低代数的细胞株在液氮中。为了保持该分离系统的敏感性，当细胞复苏后被连续传1520代，或总代数达到40代以上时，可以用已知滴度的阳性质控病毒来检验MDCK细胞系的敏感性。如果细胞的敏感性已经下降，即应复苏新的细胞株。所用细胞系应确保无支原体污染。（六）MDCK细胞系的敏感性的检测选择已知TCID50的流感病毒,在同一条件下分别感染早代（小于30代）的细胞株和现有的细胞株，对其进行TCID50测定。如果测试的TC1D50比早代的低2个或以上1g,表明其对病毒的敏感性已下降，不应继续使用；如果两者相差不超出一个1g,表明可继续使用。