DB6505T 1232023省际公路检查站非洲猪瘟监测技术规程.docx

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1、ICS65.020.20CCSB41B6505哈密市地方标准DB6505/T1232023省际公路检查站非洲猪瘟监测技术规程Technica1Regu1ationsforAfricanswinefevermonitoringatprovincia1highwayinspectionstations2023-12-30实施2023-11-30发布哈密市市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1-2023文件化工作导则第1部分：文件化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由哈密市动物疫病预防控制中心提出。本文件由哈密市农业农村局归口。本文件起草单位：哈密市动物疫病预防控制中心。本文件起草人：段进刚

2、、关团、陈建豪、买吾兰、张国新、杨帆、杨娴靖、何波本文件实施应用中的疑问，请咨询哈密市动物疫病预防控制中心。对本文件的修改意见建议，请反馈至哈密市动物疫病预防控制中心（哈密市八一路26号）、哈密市市场监督管理局（哈密市前进西路14号）哈密市动物疫病预防控制中心联系电话：0902-2317228,传真：0902-2317228,邮编：839000哈密市市场监督管理局联系电话：0902-2250279,传真：0902-2251069,邮编：839000省际公路检查站非洲猪瘟监测技术规程1范围本文件规定了省际公路检查站非洲猪瘟的临床诊断、样品采集、实验室检测、疫情处置等监测技术要求。本文件适用于哈密

3、市域内省际公路检查站非洲猪瘟的监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出入境动物检疫采样GB/T18648非洲猪瘟诊断技术非洲猪瘟疫情应急实施方案(2023年第五版)中华人民共和国农业农村部3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。21非洲猪瘟AfiricEnswinefever(ASF)由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征。世界动物卫生组织(O1E

4、)将其列为法定动物报告疫病，我国列为一类动物疫病。a，实时荧光RT-PCRrea1-timeRT-PCR实时荧光定量反转录-聚合酶链反应，在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Ct值Ctva1ue每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数。4缩略语下列缩略语适用于本文件PBS：磷酸盐缓冲盐水(Phosphatebufferedsa1inebuffer)RNA：核糖核酸(Ribonuc1eicacid)E1ISA：酶联免疫吸附试验(EnZyme1inkedimmunosorbentassay)5临床诊

5、断K1流行病学调查5.1.1 动物检疫证明注明免疫过猪瘟、高致病性猪蓝耳病等疫苗且在有效免疫期内，但运输途中有发病或病死的生猪。5.1.2 车上发病或死亡的生猪有疑似非洲猪瘟的临床症状。5.1.3 在运输途中与其他拉运ASF检测阳性生猪车辆有过接触或到过疫区。5.1.4 运输途中有可能装卸非动物检疫证明所注原产地的生猪。耳9临床症状生猪出现如下症状之一： 发病率、病死率超出正常范围或无前兆突然死亡。 皮肤发红或发紫。 出现高热或结膜炎症状。关节肿胀、皮肤溃疡。 出现腹泻或呕吐症状。 出现神经症状。 母猪出现流产、死胎。51病理变化生猪出现如下变化之一： 脾脏异常肿大。 脾脏有出血性梗死。 下颌

6、淋巴结肿胀或出血。 腹腔淋巴结肿胀或出血。 关节炎。心包积液、绒毛心。勺A可疑病例符合上述5.1、5.2、5.3各条款之一的，判定为可疑病例。6样品采集A1采样要求1.1.1 对拉运生猪车辆中临床诊断判定为可疑的病例进行样品采集。1.1.2 每辆采集样品的车辆需填写动物样品采集登记表。动物样品采集登记表见附录A。A)试剂6. 2.10.1mo1/1PBS(pH7.4),配制方法见附录B.1。7. 2.250%甘油-PBS保存液，配制方法见附录B.2o6.2.3青霉素，浓度为10000IU/m1o6.2.4链霉素，浓度为IooOogm1A1采样用具6.3.1采样工具：医用棉签、解剖刀、剪刀、镶子

7、、注射器(51)、组织匀浆器、离心管(2m1)、真空采血管(含EDTA抗凝剂)等。6.3.2采样记录用具：动物样品采集登记表、中性笔、记号笔、标签等。6.3.3样品保存用具：保温箱、样品保存管、冰袋等。6.3.4个人防护用具：防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。A4口鼻拭子采集6.4.1采集病死猪或发病猪的口鼻拭子样品。6.4.2用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口腔、鼻腔的分泌物。6.4.3蘸取分泌物后，立即将拭子浸入1m150%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管盖。6.4,4标记样品编号，立即进行ASF病原检测或密封后冷冻储存备用。A勺全血样品采集6.5.

8、1使用真空采血管(含EDTA抗凝剂)采集发病猪全血5m1o6.5.2标记样品编号，立即进行ASF病原检测或密封后冷冻储存备用。AA血清样品采集6.6.1采集发病猪全血5m1,冬季采血时防止血液冻结。6.6.2室温放置12h24h,分离血清，装入离心管中。6.6.3标记样品编号，立即进行ASF抗体检测或密封后冷冻储存备用A7组织样品采集6.7.1采集病死猪或发病猪的组织样品。首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结。6.7.2脾脏采集3cm3Cn1大小，扁桃体整体采集，淋巴结选取出血严重的整体采集，将所采集样品放入50%甘油-PBS保存液中。6.7.3取适量(0.2g1g)采集的组织样品置于组织匀浆器中充

9、分研磨，加入终浓度为1000IUm1的青霉素、IOoOgm1的链霉素，灭菌的0.1mo1/1PBS(PH7.4)的匀浆介质制备10%组织匀浆液(匀浆介质的体积总量为组织块重量的9倍)。2000r/min离心处理10min。6. 7.4取上清液，标记样品编号，立即进行ASF病原检测或密封后冷冻储存备用。AA环境样品采集6.8 .1取适量运输车辆内部粪便或垫料，放入含1m10.1mo11PBS(PH7.4)缓冲液的2m1离心管中，盖紧管盖，摇动或旋涡混匀。6.9 .2离心取上清液，移入新的离心管并标记样品编号，立即进行ASF病原检测或密封后冷冻储存备用。AQ样品保存和运输6.9.1用于非洲猪瘟检测

10、的样品应2Z8C冷藏运输，尽快（24h内）送达实验室。6.9.2用于病毒核酸或血清抗体检测的样品，应在2C8C暂存（24h内），-2Oc或-70C较长时间保存。6.9.3用于PCR等病毒核酸检测的血液应使用EDTA抗凝。6.9.4样品送样量应达到初筛检测和确诊送样的需要，符合GB/T18088要求。7样品接收71实验室检测人员接收动物样品采集登记表。79查看动物样品采集登记表是否填写完整、是否签字确认。7查看采集的样品是否合格，如样品标记是否清晰，有无变质腐败、血液样品有无溶血，采集部位是否符合检测要求。7A填写样品接收登记表。样品接收登记表见附录Co8实验室检测A1实时荧光RT-PCR核酸检

11、测8.1.1概述采用非洲猪瘟实时荧光RT-PCR试验检测口鼻拭子、全血样品、组织样品、环境样品中非洲猪瘟病毒核酸。8.1.2病毒核酸提取8.1.2.1应用市售商品化检测试剂盒配套使用的柱式抽提试剂盒，按使用说明书人工提取病毒核酸。8.1.2.2应用市售商品化自动提取试剂盒，按使用说明书在自动核酸提取仪上进行编程并提取核酸。8.1.3扩增体系的配制8.1.3.1依据GB/T18648中8.4.2.1实时荧光PCR扩增试剂配制扩增体系。8.1.3.2亦可用市售商品化非洲猪瘟实时荧光PCR试剂盒配制扩增体系。8.1.4扩增条件设置8.1.4,1推荐实时荧光定量RT-PCR反应条件：第一阶段，50孵育

12、2min；第二阶段，95预变性5min；第三阶段，95变性15S；第四阶段，58退火延伸1min,45个循环，在每个循环的58时收集FAM荧光信号。1.1.1 1.4.2选用商品化非洲猪瘟毒通用型实时荧光RT-PCR试剂盒，扩增条件参照说明书设置。8.1.5 结果分析条件设定读取样本检测结果。一般为自动设置阈值，也可根据正常阴性样本扩增曲线合理调整阈值。8.1.6 质控标准8.1.6,1阳性对照Ct值30并出现特异性扩增曲线。8.1.6.2阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值240并且无特异性扩增曲线。8.1.6.3同时满足以上两个条件，试验有效；否则应重新进行试验。8.1.7结果判定8.1.7.

13、1被检样品Ct值W38,且出现典型的扩增曲线，判定为ASFV核酸阳性。8.1,7.238Ct值W40且出现特异性扩增曲线，则判定为疑似。对疑似样品，模板量加倍（41DNA模板）进行1次复检，做3个重复；有2个重复Ct值40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV核酸阳性，否则判为ASFV核酸阴性。8.1,7.3无Ct值或Ct值240,则判为ASFV核酸阴性。8.1,7.4若选用商品化非洲猪瘟通用型实时荧光RT-PCR试剂盒，则参照说明书判定。A5血清学检测抗体检测可采用间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验等方法。具体方法参照GB/T18648检测。A1检测结果出具和报告8.3.1检测结果出来后

14、及时填写检测结果记录单。检测结果记录单见附录Do8.3.2若检测结果为阴性，将检测结果直接报告给检查站负责人。8 .3.3若检测结果为阳性，将检测结果逐级上报，并填写样品送检登记表。样品送检登记表见附录Eo9疑似非洲猪瘟疫情处理01对非洲猪瘟临床疑似病例运输车辆及牲畜实施隔离、监控，禁止牲畜、车辆随意移动，并对其外环境进行严格消毒。9 3将疑似非洲猪瘟阳性样品按照5.3.6中的要求送往哈密市动物疫病预防控制中心复检。10 4哈密市动物疫病预防控制中心复检后仍有阳性或可疑，按5.3.6中送检要求，送检自治区动物疫病预防控制中心复检，并送国家指定参考实验室确诊。0A对于确诊为非洲猪瘟疫情的，参照非

15、洲猪瘟疫情应急实施方案（2023年第五版）（农牧发20237号）执行。10消毒11人员及物品消毒10.1.1 参与相关工作人员的手及皮肤裸露的部位首先用肥皂清洗，然后用酒精消毒凝胶或碘类制剂进行消毒。10.1.2 对衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取消毒液浸泡、高压灭菌等方式消毒。13车辆和场地的消毒10.2.1 对车辆的消毒。车辆消毒前必须彻底清洗，清除有机物、污物、粪便、饲料、垫料等，可采用酚类、戊二醛类、季铁盐类、复方含碘类（碘、盐酸、硫酸复合物）、过氯乙酸类消毒剂，以清洗、喷洒等方式消毒。10.2.2 道路、停车场及大门口的消毒。采用氢氧化钠、氢氧化钙等消毒剂，以清洗、喷洒等方式消毒。12检查站其他设施设备及场所的消毒检查站其他设施设备及场所等的消毒具体参照附录F执行。附录A（资料性）动物样品采集登记表检查站（采样单编号）非洲猪瘟样品采集登记表采样时间：年月日时分No:（检疫证编