国家自然基金申请书写作：7-DNA拷贝数变化.docx

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1、分子机制研究套路(七)拷贝数变异课题：A基因拷贝数变异与B疾病发生的相关性研究1 .概念介绍：近来的研究表明在人类与其他哺乳类动物基因组序列中DNA拷贝数变异(CoPynumberVariatiOn,CNV)在生物的进化、发育及疾病的发生、发展过程中均具有重要作用。所谓拷贝数变异是指与基因组参考序列相比，基因组中1kb的DNA片段插入、缺失和/或重复，及其互相组合衍生出的复杂变异，主要表现为亚微观(SUbmiCrOSCoPiC)片段的缺失和重复。CNV是基因组结构变异(StrUCtUra1VariatiOn)的重要组成部分。CNV位点的突变率远高于单核甘酸多态性(Sing1enuc1eotid

2、epo1ymorphism,SNP),是人类疾病的重要致病因素之一。CNV的形成机制有多种，可分为DNA结构重抖厢DNA错误复制两大类。CNV可以导致呈孟德尔遗传的单基因病与罕见疾病，同时也与复杂疾病相关，包括癌症。其致病的可能机制有基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等。例如，拷贝数变异可以通过破坏蛋白编码基因的活性部分、改变某个基因的表达量”或者破坏基因活性的调控区域，从而影响基因的活性。越来越多的证据显示基因组DNA拷贝数变异是肿瘤相关基因活性改变的一个重要的调控因素。值得注意的是，拷贝数变异(CoPynumbervariation,CNV)这一术语主要是指遗传性的/胚系(Inhe

3、rited/germ1ine)拷贝数变化，与之对应的另一术语拷贝数畸变(CoPynumbera1teration,CNA)”主要是指体细胞(SomatiC)拷贝数变化，例如在癌症发生过程中新出现的DNA片段拷贝数变化。2 .研究思路：2.1 研究婕的采集22.2 A基因全部25个外显子区域CNV的变化223A基因14号外显子杂合性缺失的验证22.4 A基因14号外显子杂合性缺失的组织特异性22.5 A基因14号外显子杂合性缺失对蛋白表达的影响221研究对象的采集本研究共纳入一例B疾病患者和一例健康者。两组研究对象的性Sik年龄、受教育程度等情况无明显差异。2.6 A基因全部旦个外显子区域CNV

4、的变化对基因组个外显子区域CNV的检测显示，第外显子病例组有一杂合性缺失，在DGV数据库中未发现此微缺失的报道。第Z1和21外显子病例和对照组均有拷贝数增加，两组无明显差异。其余外显子未检测到拷贝数变异。我们抽取了一个样本用Rea1-timePCR进行了第也号外显子和第勘号外显子拷贝数检测。结果显示，除红号外显子有一个标本两者的检测结果不一致外，其余检测检测结果一致。2.7 A基因M1号外显子杂合性缺失的验证采用PCR后测序的方法，对口号外显子有杂合性缺失的样本进行了验证，结果显示这一标本在14号外显子处有一约40ObD的杂合性缺失；采用PCR的方法，对_例健康者DNA进行了号外显子的杂合性缺

5、失的检测，未发现缺失。2.8 A基因M1号外显子杂合性缺失的组织特异性对脊髓、肝、心、肺、肾、皮肤组织采用PCR的方法检测了号外显子的CNV情况，结果显示脊髓、肝、心、肺、肾、皮肤组织均具有相同的14号外显子的缺失。2.9 A基因及号外显子杂合性缺失对蛋白表达的影响Western-b1ot的结果显示,号外显子的缺失破坏影响了WOkDa的异构体蛋白的表达,而对150、18OkDa异构体蛋白表达的影响不明显。心和肾组织的表达无明显差别。三级结构的预测显示项必亚型发生缺失后，产生一种完全不同的蛋白,而150、18OkDajIE发生号外显子编码的氨基酸缺失后，13号外显子和后面15号夕卜显子编码的氨基酸连接，能形成一个和缺失前三级结构类似的结构，原来的电荷、酸碱度都未发生明显改变，加之是杂和性缺失，可能导致从WeStemb1Otting结果上看不出非常明显的改变。3 .应用案例：1. GaoY,ChenX,ShangguanS,BaoY,1uX,ZouJ,GuoJ,DaiY,ZhangT:AssociationstudyofAgenepo1ymorphismswithneura1tubedefectsinaChineseHanpopu1ation.Reproductivesciences(ThousandOaks,Ca1ifi2012,19(7):764-771.