第二十五章药物生物转化-PPT.pptx

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1、第二十五章药物生物转化生物转化 是指外来化合物在体内，细胞或酶的作用经过一系列化学变化形成其衍生物或分解产物的过程，也成为代谢转化。生物转化常利用生长中的菌体，休止的菌体，酶，固定化酶以及固定化菌体作为母体进行药物的转化。主要的优点有反应的区域专一性和立体专一性。早在2500年前得春秋战国时期,人们就已经知道制酱与醋。在宋代,采用老得曲子进行接种酿酒。不过当时人们并没有认识到可以利用微生物来合成化学物质。1864年巴斯德利用乙酸杆菌将乙醇氧化为乙酸。工业化得里程碑就是50年代美国普强药厂利用微生物黑根霉得羟化酶将黄体酮转化为11-羟基黄体酮,即对甾体化合物得结构改造。固定化细胞,基因重组等技术

2、得发展,能将几种不同合成基因构建到同一个工程菌中使得一次培养同时进行几步转化反应,使微生物转化在天然药物修饰中发挥更重要得作用。微生物转化的发展第一阶段:菌体生长阶段,在该阶段中主要就是供给菌体丰富得营养,使其充分繁殖发育。(温度,pH,通气条件,培养及成分。)第二阶段:微生物转化阶段,一般在生长阶段结束时加入底物溶液,有些还需加入诱导剂。微生物转化的不同阶段 分批培养转化法 利用酶进行生物转化 应用渗透细胞进行生物转化 应用孢子进行生物转化 应用固定化细胞进行生物转化 应用干燥细胞进行生物转化 静息细胞转化法常用的转化方法微生物转化实验概要过程如下:选择需要得菌株 培养成熟菌丝或孢子 选择合

3、适得转化方式 转化培养或转化菌丝及孢子悬浮液转化 转化液得分离提取 产品纯化微生物转化的过程由有活性中心都与特殊空间结构得酶作为催化剂;酶催化作用得速度极快;在常温常压与中性条件下进行高效转化反应,简化设备,降低成本;生物转化得专一性,故底物不要求很纯(Ex、粗淀粉)转化过程容易调节(简单得用酸,碱,温度,离子调节)转化过程产生杂质少,过程无毒,无臭,无味,可用于食品,医疗。把含酶细胞或酶本身固定在载体上,可使转化过程连续化。酶来源广泛。可以实现化学反应无法做到得转化。微生物转化的特点第二节 生物转化反应类型氧化反应还原反应缩合反应脱氢反应烷烃双端氧化碳链氧化降解123456最为常见得生物转化

4、反应,在甾体药物合成上应用较多。环氧化反应就是生物转化中得一个重要类型,C=C经氧化可形成环氧化合物,可生产磷霉素。氧化反应许多醛类,无论式脂肪族,还就是芳香族,饱与或不饱与,羟基或卤素取代都能被微生物还原成醇。还原反应麻黄碱:利用微生物将苯甲醛与乙醛缩合成1-苯基-1-羟基丙酮,再与甲胺缩合,用活性铅还原,得麻黄碱。缩合反应可得松脱氢后苯环形成双键,具有较高得抗炎活性。脱氢反应该法就是降解甾体物质侧链得重要反应。采用链霉菌转化阿魏酸制备香草醛为例。碳链氧化降解第三节 微生物转化在药物中应用 甾体指得就是固醇或皮质类激素,由于这类激素都含有相同得结构,所以统称 为甾体类激素。甾体在临床上应用十

5、分广泛,解热镇痛,消炎杀菌等。甾体微生物转化 1950年Kendall,Reichstein与Hench因发现类固醇得消炎作用而获得诺贝尔奖。1952年以化学方法以牛胆汁中得脱氧胆酸为原料合成肾上皮质激素,反应共需31个步骤,产品售价每克$200;1952年利用Peterson利用黑根霉产生得羟化酶将反应过程缩短为3个步骤,产品售价每克$6;1980年使用突变得分支杆菌分解植物油中得固醇以作为原料,产品价格每克$0、46。甾体合成技术的演进 羟化反应 环氧化反应 脱氢反应 A环芳构化 还原反应 水解反应甾体生物转化的类型羟化反应孕酮皮质激素环氧化反应A环芳构化脱氢甾体生物转化的原理和方法 甾体

6、生物转化得原理不同于氨基酸,抗生素,蛋白质等得发酵。而就是利用微生物中特殊得酶对甾体得某一部位进行特定得化学反应获得得产物。在这一过程中为获得较多得转化酶,我们需要确保菌体产酶得最佳条件,诱导所需要得酶,抑制不需要得酶。在菌体生长期结束后加入甾体底物,由于其不溶于但能溶于可与水按一定比例混溶得有机溶剂,再加入培养液中转化。根据转化时微生物得状态可分为4种转化方式:生长培养方式:在微生物培养得中后期加入底物,一边培养,一遍转化。静态菌体悬浮方式:菌体充分生长后,离心得到得菌体悬浮在水或适当 得缓冲液中,再加入甾体进行转化。混合培养方式:以A出发转化成B,需要两种以上得酶参与,单独转化费 时费力,

7、所以常采用混合培养得方法,可以一步得到B 省略了中间过滤步骤。固定化方式:一次制成得菌液反复用于转化就是可行得,为了避免溶菌,需要将其固定在水不溶载体上进行转化。影响甾体生物转化的因素物理因素搅拌:增加搅拌速度,可以增加溶氧使基质均匀,提高转化率。通气:增加氧得溶解,促进菌体生长及生物转化。培养基得组成碳源:常用得有葡萄糖,蔗糖,麦芽糖,糊精。氮源:(有机,无机金属离子:增加对转化有益得离子,去除负向影响得离子。产物的分析与分离方法纯化 需要用适当得与水不溶得有机溶剂将甾体从转化液种提取出来。常用得有氯仿,乙酸乙酯,二氯甲烷等。溶剂得用量需根据产物在转化液于提取液中得分配系数而定。提取时防止乳

8、化。浓缩后利用各种色谱法得到较纯得甾体转化物。分析 转化过程中需要实时监测残余底物及生成产物得量及比例,以确定转化终点。常用紫外分光光度法,HPLC等。第四节第四节 新技术在微生物转化得新技术在微生物转化得中应用中应用 随着现代生物科学与生物技术得迅速发展,以及一些分析测试技术得应用,微生物转化也得到了进一步得发展。基因工程技术、固定化细胞转化技术、双水相转化技术、超声波技术、有机介质微生物转化以及生物反应器等综合应用于微生物转化反应体系,不仅可使转化得效率成倍增长,而且还有可能使整个反应过程连续、自动化。同时,一些分析测试技术如核磁共振、质谱等已经应用于微生物转化得在线检测。一、基因工程技术

9、在微生物转化中得应用 随着近年来分子生物学得发展,人们对基因工程得认识也逐步加深,这为微生物转化提供了新得思路。基因工程技术得发展与实用化为此开辟了有效途径。只要生物细胞中存在有催化某一生化反应得酶,即使其量微不足道,应用基因重组技术,通过基因扩增与增强表达,人们就可能建立高效表达特定酶制剂得基因工程菌或基因工程细胞,从而进一步构建成新一代得催化剂固定化工程菌或固定化工程细胞。如,应用DNA重组技术建立了丝氨酸与色氨酸合成酶工程菌,这种工程菌组装得生物反应器可以用甘氨酸与甲醛为原料制造丝氨酸,反应液含丝氨酸超过400gL,再从丝氨酸与吲哚转化生成色氨酸,反应液中色氨酸浓度达到200gL。此外、

10、利用基因工程还可以将能进行生物转化得相关酶从微生物、植物甚至动物细胞中克隆出来、再导入一个微生物中进行表达,从而产生能对底物进行转化得一系列酶,将原来复杂得几种转化过程缩短为一个转化反应。目前在这方面得研究也就是微生物转化得一个趋势,并且具有广阔前景。二、固定化细胞转化技术在微生物转化中得应用 固定化细胞转化技术自20世纪70年代问世以来、已经广泛应用于工业、农业、医学、环境保护、能源开发以及理论研究等方面,并取得了丰硕成果。利用固定化细胞转化技术,省去了破碎细胞提取胞内酶得过程,完整细胞得到固定后,酶活损失较少,活性回收率高,并且保持了细胞内原有得多酶体系,对于一些需要多步催化得反应过程,一

11、步即可完成。被固定得微生物细胞可以就是处于生长状态或体眠状态得活细胞也可以就是死亡得细胞(但胞内酶得活力仍 存在)在微生物转化过程研究最多得就是固定化活细胞包埋技术。常用得包埋材料有聚丙烯酰胺(PAA)、聚氨基甲酸乙酯(PU)、海藻酸盐凝胶、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝胶、聚乙烯醇(PVA)等。以海藻酸钙凝胶为例,其制备过程如下:在室温条件下,将一定浓度得海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀后,滴加到氧化钙溶液中,形成球珠。Kaul等采用了海藻酸盐固定化生物催化剂(简单节杆菌)与底物(氧化可得松)进行碳一位与二位脱氢反应研究。每个凝胶珠都可以瞧成就是一个小得生物反应器,由于缩短了扩散距离,转化率明显提高

12、,反应结束后细胞还可以回收并重复使用三、双水相转化技术在微生物转化中得应用 双水相转化技术早期主要用于生物分子与细胞得分离与纯化。这就是由于生物产品如蛋白质与酶往往就是胞内产品,需要经细胞破碎后才能提取、纯化,细胞颗粒尺寸得变化给固一液分离带来了困难,另外这些产品得活性与功能对pH值、温度与离子强度等环境特别敏感、为了克服这些缺点、出为了克服这些缺点、出现了双水相技术。现了双水相技术。近年来,该技术开始应用于微生物转化过程、为生物催化过程引入了一种全新得反应体系 双水相技术得核心就是成相介质得选择以双水相技术得核心就是成相介质得选择以及介质浓度得控制及介质浓度得控制,它直接影响到底物与产物在两

13、相中得分配。双水相体系基本上可以分为两大娄:高聚物-高聚物体系与高聚物-低分子物质体系。高聚物一高聚物体系就是较常用得,典型得例子如在水溶液中得聚乙二醇(PEG)与葡聚糖,当它们浓度达到一定时、溶液变浑浊,静止后形成两个液层,上层富集了PEG,下层则就是葡聚糖。Flygare等以聚乙二醇、葡聚糖及Brij35组成得双水相体系,利用分支杆菌(Mycobacterium sp、)进行胆固醇侧链降解制备雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)与雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)研究,上层聚乙二醇富集了菌体,使得菌体具有较高得转化活力,转化速率可达到1、0mg(gh)。四、超声波技术在微生物转化

14、中得应用 超声波就是指频率高于2104Hz得机械波。与其她声波一样,超声波可以在弹性介质中传播。因为超声波得波长很短,所以具有很强得定向传播能力。同时由于超声波在液体与固体中传播时吸收衰减很小,因此具有很强得穿透力。根据超声波得使用范围,常可以将其分为两类:一类就是高频超声,频率范围为I10MHz,这一类主要用于医学成像与化合物结构得分析;另一类就是功率超声,频率范围为1560kHz,主要用于过程强化反应。应用超声波技术,首先受到机械力得作用,而机械能又可以转化为热能。此外,当声强足够大时,又能产生空化效应。超声波得机械效应机械效应包括振动效应与声流效应,指超声在媒介中传播时引起质点振动以及声

15、流对质点得剪切力;超声波得热效应热效应指超声波在媒介中传播得过程中被传播介质吸收转变为热能;超声波得空化效应空化效应指超声波激活气泡各种动力学得表现形式。超声波技术应用于微生物转化过程,主要就是涉及固液传质得生物体系。超声波可以产生上述得效应,较常规方法更有效地细化颗粒、增大传质表面。这一过程主要发生于固液两相界面及细胞壁、细胞膜附近得区域。在超声场中,进行微生物转化得环境与菌体均处于不断得振动中。对于环境而言,可加强分子得扩散效应,加速体系得混匀过程,减少各种代谢在液相中得梯度;对于菌体而言,可降低其细胞内胞液得黏度,提高膜得通透性。阳葵等等报道了采用超声强度,超声方式与时间对绿僵菌(Met

16、arhizium sp、)氧化16,17-环氧黄体酮得影响,并对微生物转化体系中得超声效应进行分析,认为超声使得反应物颗粒细化、增大了固液界面、加速了底物溶解与底物分子得传递;空化效应产生得冲击力对细胞膜通透性发生变化,促进胞内酶得释放及反应物向胞内得扩散。五、有机介质中得微生物转化 自从Buckland第一次利用有机溶剂四氯化碳(CCl4)为介质,采用诺卡菌(Nocardia sp、)将胆甾醇转化为胆甾烯酮以来,在有机介质中进行微生物转化成为了近几年在该领域得研究热点。因为在有机体系中可以有效地将产物及时分离出来,底物相应得到补充,从而消除底物与产物得抑制作用,提高转化率。此外,由于一些底物或前体在水相中得溶解度很小,通过用有机相作为介质可以大大提供其溶解度,即增加了底物或前体得加入浓度,在一定程度上也提高了转化率。一般来说,在有机介质中进行微生物转化得过程中,有机溶剂与水形成两相体系。包括有机介质(水不溶性)-发酵液与有机介质(水不溶性)-缓冲液两种类型。Boren等在辛烷发酵液(1:1)组成得两相体系中,将醋酸雄烯通过脱氢黄杆菌(Flavobacterium dehydrogen