二倍体细胞库建立标准操作SOP.docx

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1、二倍体细胞库建立标准操作SOP编号：S0P-Z1055-00页码：14版本号：01修订号：00机密等级：秘密起草人起草日期颁发部门质量管理部审核人审核日期批准人批准日期生效日期分发清单研发部质量管理部综合管理部生产管理部市场销售部财务部1. 目的为了规范细胞库管理人员在主细胞库、工作细胞库建立过程中复苏、传代、冻存的标准操作。2. 适用范围本规程适用于人胚肺二倍体细胞(2BS株)主细胞库、工作细胞库的建立。3. 职责3.1. 细胞培养岗位人员：负责严格按照本标准操作规程进行操作。3.2. 细胞组长：检查细胞组人员的生产操作情况，确保操作的正确性。3.3. 质量管理员：监督、检查本文件的执行情况

2、。4. 术语4.1. 主细胞库(MaSterCe11Bank,MCB)：由原始细胞库(PrimaryCe11Bank)的细胞制备而成，分装于容器内，组成应均一，保存于-130或以下，用于制备工作细胞库(WorkingCe11Bank,WCB)。本细胞库的细胞无论开瓶与否，均不得再返回贮存。4.2. 工作细胞库(WorkingCe11Bank,WCB)：由有限传代水平的主细胞库制备而来的均一性细胞悬液，分装适宜体积于多个容器中，冻存于73OC或以下用于生产。本细胞库的细胞无论开瓶与否，均不得再返回贮存。5. 材料及设备5.1. 高压蒸汽灭菌类：橡胶塞、吸管(1m1、2m1.IOmD.毛吸管、Io

3、oInI方瓶、25Om瓶、IOOm1离心瓶、2m1冻存管、不锈钢盆、不锈钢桶、无毛抹布、吸球、C级区洁净服及口罩。5.2. 消毒剂：1%(m1m1)来苏儿、5%(m1m1)来苏儿、1%o(m1m1)新洁尔灭、5%o(m1m1)新洁尔灭。5.3. 无菌液体：025%胰蛋白酶、8.0%(gm1)碳酸氢钠、对照新生牛血清、新生牛血清、E-MEM培养基、3.0%谷氨酰胺、二甲基亚碉、0.4%台盼兰。5.4. 设备：倒置显微镜、离心机、低温冰箱、电热恒温水浴箱、层流罩、液氮罐处于完好清洁状态。5.5. 其他物品：止血钳、冻存盒、医用手套、斜面架6. 流程图见附件1人胚肺二倍体细胞（2BS株）细胞库建立工

4、作流程图7. 内容7.1. 工作代细胞库建立7.1.1复苏（18-19代）7.1.1.1生产前检查（1）工作环境确认：细胞制备间（一）（29WXBZBJYC/A-08）在C级局部A级洁净区内进行，温度控制在1526,相对湿度控制在3070%,相对压差25Pa.确认场地清场合格，无上批次生产遗留物，将清场合格证贴在本批次对应的记录内。（2）设备、设施确认：a.按照层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程确认层流罩处于完好状态。b.按照倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程确认倒置显微镜处于完好状态。c.按照恒温室管理标准操作规程（使用、清洁、维护、保养）确认恒温室运行状态良好。d.按照电热恒温

5、水浴箱使用、清洁、维护保养标准操作规程确认电热恒温水浴箱处于完好状态。确认上述设备、设施完好且均在清洁、消毒有效期内。（3）文件记录检查确认本工序标准操作规程、空白批生产记录和所用的标签、状态卡已经到位。（4）消毒剂确认确认1%。新洁尔灭、5%。新洁尔灭、1%和5%来苏儿的批号和有效期。7.1.1.2操作前准备：（1）按照工艺规程要求进行相应物品的准备工作。(2)无菌液体确认：从低温冰库中取出025%胰蛋白酶、3.0%谷氨酰胺、新生牛血清，核对批号、有效期，融化后待用；核对&0%(gm1)碳酸氢钠、EfEM培养基的批号和有效期，用1%。(m1m1)新洁尔灭或1%(m1m1)来苏擦拭所有无菌液体

6、瓶的外表面，经缓冲间进入C级区。(3)细胞种子确认：确认细胞名称、代次、批号及复苏支数。7.1.1.3生产操作(1)液体配制操作前30分钟打开层流罩，日光灯。a.复苏液81.2%(m1m1)E-MEM+16.2%(m1m1)新生牛血清+0.9%(m1m1)(3.0%谷氨酰胺)+1.6%(m1m1)(8.0%碳酸氢钠)。按配方计算出配制一定体积的复苏液所需E-MEM、新生牛血清、3.0%谷氨酰胺、8.0%碳酸氢钠的体积；用IOm1吸管抽取对应体积的各种液体加入MEN培养基中，盖橡胶塞摇匀待用。b.生长液：87.4%E-MEM+10%(m1m1)新生牛血清+0.9%(m1m1)(3.0%谷氨酰胺)

7、+1.7%(m1m1)(8.0%碳酸氢钠)。按配方计算出配制一定体积的生长液所需E-MEM、新生牛血清、3.0%谷氨酰胺、8.0%碳酸氢钠的体积；用Iom1吸管抽取对应体积的各种液体加入MEN培养基中，盖橡胶塞摇匀待用。(2)速融电热恒温水浴箱设置温度为37C；当水温达到37。C时，带上手套，按标签所示取出装有人胚肺二倍体细胞的冻存管，检查外观无破损；核对批号、代次无误后立即放入电热恒温水浴箱内，速融在1分钟完成。(3)分种细胞速融后，立即送入细胞制备间，在A级工作台下用1%。新洁尔灭或1%来苏儿将冻存管表面彻底消毒。打开冻存管，用IInI吸管吸取0.5m1复苏液加入冻存管中；用毛细管将冻存管

8、中液体吸出，加入到一个100InI方瓶中(已预先加入适量复苏液)，按此法，将全部细胞种子加入IOOmI方瓶中；用毛细管充分吹打混匀，用IOm1吸管按1:2分种率分种于Ioom1方瓶中，每IOom1方瓶补加复苏液至1316m1,盖橡胶塞，细胞面朝下放置。(4)培养在方瓶瓶壁上标记批号、代次、复苏日期，放入37C0.5C恒温室中静止培养610小时后换液。(5)换液a.细胞观察待细胞已均匀贴壁即可准备换液。b.换液在操作间A级工作台，倒弃旧液，分别加入15m1生长液。(6)培养方瓶放入370.5恒温室中静止培养。(7)操作过程中出现偏差的情况按照偏差管理标准操作规程进行处理。7.1.1.4清场(1)

9、在生产完成后清场操作前需在房间门上悬挂“待处理”标志牌，关闭层流罩，日光灯。(2)按生产区清场、清洁、消毒管理标准操作规程对操作区域进行清洁、消毒。(3)集液槽用5%。(m1m1)新洁尔灭或5%(m1m1)来苏儿溶液清洗消毒及液封。(4)按要求正确悬挂状态标识。(5)废弃物装袋放固定位置送出。7.1.1.5细胞观察观察细胞形态是否为典型成纤维状细胞、细胞是否贴壁、伸展、有无污染以及是否光亮透明。于传代后第一天、第二天、第三天各观察一次，并做记载。7.1.1.6及时填写人胚肺二倍体细胞(2BS株)工作代细胞库建立记录。7.1.2IOOm1方瓶细胞传代(19-21代)7.1.2.1生产前检查(1)

10、工作环境确认：细胞制备间：在C级局部A级洁净区内进行，温度控制在1526,相对湿度控制在3070%,确认场地清场合格，无上批次生产遗留物，将清场合格证贴在本批次对应的记录内。(2)设备、设施确认：a.按照层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程确认层流罩处于完好状态。b.按照倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程确认倒置显微镜处于完好状态。C.按照恒温室管理标准操作规程(使用、清洁、维护、保养)确认恒温室运行状态良好。&确认上述设备、设施完好且均在清洁、消毒有效期内。(3)文件记录检查确认本工序标准操作规程、空白批生产记录和所用的标签、状态卡已经到位。4)1%。新洁尔灭、5%。新洁尔灭、1%

11、来苏儿、5%来苏儿的批号和有效期7.1.2.2操作前准备(1)按照工艺规程要求进行相应物品的准备工作，并确认其在灭菌有效期内。(2)无菌液体确认：从低温冰库中取出025%胰蛋白酶、3.0%谷氨酰胺、新生牛血清，核对批号、有效期，融化后待用；核对8.0%(gm1)碳酸氢钠、E-MEM培养基的批号和有效期，用1%o(m1m1)新洁尔灭或1%(m1m1)来苏儿擦拭所有无菌液体瓶的外表面，经缓冲间进入C级区。(3)细胞确认：确认细胞代次、数量、瓶型、日龄及细胞生长情况。7.1.2.3操作过程(1)液体配制：操作前30分钟打开层流罩，日光灯。a.消化液：以40OnII体积装量的浓度为0.25%胰蛋白酶为

12、基质液，加入2.0%(m1m1)(8.0%碳酸氢钠)，盖橡胶塞摇匀待用。b.生长液：87.4%E-MEM+10%(m1m1)新生牛血清+0.9%(m1m1)(3.0%谷氨酰胺)+1.7%(m1m1)(8.0%碳酸氢钠)。按配方计算出配置一定体积的生长液所需E-MEM、新生牛血清、1-谷氨酰胺、碳酸氢钠的体积；用IOm1吸管抽取对应体积的各种液体加入E-MEN培养基中，盖橡胶塞摇匀待用。(2)消化：弃方瓶内生长液，加46m1消化液，待细胞表面呈松散状时弃消化液。(3)传代：每个100InI方瓶内加8m1生长液，用IOInI吸管反复吹打细胞面，使所有细胞从瓶壁上脱下悬入生长液中，再吹打细胞使之分散

13、成单个状态；以1:4分种率分种方瓶内，每个IOom1方瓶补加生长液至1316m1,轻轻摇匀后盖橡胶塞。(4)培养：在方瓶瓶壁上标记批号、代次、传代日期，放入37C0.5C恒温室中静止培养。(5)操作过程中出现偏差的情况按照偏差管理标准操作规程进行处理。7.1.2.4清场：(1)在生产完成后清场操作前需在房间门上悬挂“待处理”标志牌，关闭层流罩，日光灯。(2)按生产区清场、清洁、消毒管理标准操作规程对操作区域进行清洁、消毒。(3)集液槽用5%。(m1m1)新洁尔灭或5%(m1m1)来苏儿溶液清洗消毒及液封。(4)按要求正确悬挂状态标识。(5)废弃物装袋放固定位置送出。7.1.2.5细胞观察观察细

14、胞形态是否为典型成纤维状细胞、细胞是否贴壁、伸展、有无污染以及是否光亮透明、致密单层。于传代后第一天、第二天及第三天各观察一次，并做记载。7.1.2.6及时填写人胚肺二倍体细胞(2BS株)工作代细胞库建立记录。7.1.3细胞传代(21f23)此项传代程序同7.1.2项。7.1.4细胞传代(2324)细胞传代时分种率为1:2,其他程序同7.1.2项。7.1.5换液7.1.5.1生产前检查(1)工作环境确认：细胞制备间(一)在C级局部A级洁净区内进行，温度控制在1526,相对湿度控制在3070乐确认场地清场合格，无上批次生产遗留物，将清场合格证贴在本批次对应的记录内。(2)设备、设施确认：a.按照

15、层流罩使用、清洁、维护保养标准操作规程确认层流罩处于完好状态。b.按照倒置显微镜使用、清洁、维护保养标准操作规程确认倒置显微镜处于完好状态。C.按照恒温室管理标准操作规程(使用、清洁、维护、保养)确认恒温室运行状态良好。d.确认上述设备、设施均在清洁、消毒有效期内。(3)文件记录检查确认本工序标准操作规程、空白批生产记录和所用的标签、状态卡已经到位。(4)消毒剂确认确认1%。新洁尔灭、5%。新洁尔灭、1%来苏儿、5%来苏儿的批号和有效期。7.1.5.2操作前准备：(1)按照工艺规程要求进行相应物品准备工作，并确认其在灭菌有效期内。(2)无菌液体确认：从低温冰库中取出0.25%胰蛋白酶、3.0%谷氨酰胺、新生牛血清，核对批号、有效期，融化后待用；核对&0%(gm1)碳酸氢钠、E-MEM培养基的批号和有效期，用1%。(m1m1)新洁尔灭或1%(m1m1)来苏儿擦