异鼠李素对黑色素瘤细胞黑色素合成相关基因表达量的影响分析.docx

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1、异鼠李素对黑色素瘤细胞黑色素合成相关基因表达量的影响分析摘要：异鼠李素（ISorhamnetirI）是一种丰富存在于鼠李属植物中的黄酮醇类黄酮化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化等生物活性，细胞毒性较低，可应用于肿瘤、心血管疾病防治等诸多方面，为了探讨异鼠李素对B16细胞黑色素生物合成途径中关键基因表达量的影响，通过将异鼠李素作用于B16黑色素瘤细胞，研究了其体外抗肿瘤作用机理。为异鼠李素体外抗黑色素瘤作用奠定了理论基础，为寻找新的抗黑色素瘤药物提供了参考。就异鼠李素对B16细胞黑色素生物合成途径中关键基因表达量的影响展开研究。通过半定量PCR检测基因MCIRM1TF、TYRTRP1、TR

2、P2的表达量，发现这些基因的表达量与异鼠李素的浓度并不成线性关系，但是异鼠李素处理组与实验组相比，TRP1和TRP2的表达量有所下降，酪氨酸酶活和黑色素含量有所下降。研究认为异鼠李素不是通过调节基因MCIRMITFsTYR、TRP1、TRP2的表达量来调节黑色素的含量，对其表达含量无作用。关键词：异鼠李素；黑色素瘤细胞；半定量PCR1前言黑色素细胞瘤是源于表皮正常黑色素细胞或原有痣细胞的一种恶性肿瘤，恶性程度高,且尚无有效的治疗方法,治愈率低，是皮肤癌致死的主要肿瘤（75%）。以往的研究表明，恶性黑色素瘤与正常黑色素细胞相比，其酪氨酸酶表达会上调并产生明显的活性提高，说明黑色素细胞瘤的发病与酪

3、氨酸酶的表达及活力具有直接关系。因此，对酪氨酸酶活性的调节和表达水平的调控是当前治疗黑色素瘤的重要方式。目前，己有报道的黑色素细胞瘤的防治手段主要有以下几种：（1）通过RT-PCR技术检测黑色素瘤病人的外周血中酪氨酸酶的表达情况，鉴定血液循环系统中是否存在黑色素瘤细胞；（2）采用抑制剂对酪氨酸酶活性进行蛋白水平的调节，通过抑制酪氨酸酶活性预防和治疗黑色素细胞瘤；（3）建立原位治疗黑色素细胞瘤的前体药物合成模型，据此筛选对黑色素细胞瘤具有治疗作用的药物等。异鼠李素是一种黄酮醇类黄酮化合物，在自然界广泛存在，尤其在银杏、沙棘等多种植物的花、果实和叶中含量丰富，具有广泛的生理和药理活性，不仅能抑制脂

4、肪细胞分化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等，而且对内皮保护、抗动脉粥样硬化、保护心肌细胞、抗血栓及血小板凝集、抗氧化等多种心脑血管保护起重要作用。近来，有研究表明，异鼠李素对酪氨酸酶的活性和细胞黑色素合成等具有明显的抑制作用。为黑色素细胞瘤防治药物的开发提供了新的思路。2材料与方法2.1 实验材料和仪器2.1.1 实验材料小鼠B16黑色素瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。2.1.2 主要试剂DMSO（Amreseo,USAPBS（Hyc1one）0.25%胰蛋白酶消化液（HyC1one）、DEME高糖培养基（HyC1one）、胎牛血清（澳洲胎牛血清，依科赛）、青-链霉素双抗（HyC

5、Ione）。2.1.3 实验仪器表1实验仪器仪器名称型号生产厂家二氧化碳细胞培养箱I1-185VTST1K公司,USA数显恒温水浴锅HH-6国华电器有限公司高速低温离心机Centrifuge5804REPPendorf公司，德国倒置显微镜TS1OONIKON,日本PH计PB-IOSartorius科学仪器有限公司琼脂糖水平电泳槽和电泳仪BG-SubMIDI北京百晶生物技术有限公司凝胶成像仪WD-9413C型EPpendorf公司，德国电子分析天平BSA224S-CWSartorius科学仪器有限公司-80超低温冰箱U9260-0001SanyO公司，日本旋涡混合器XW-80C型上海医科大学仪器

6、厂细胞培养板3799corning公司，美国细胞培养瓶3799corning公司，美国超净工作台JB-CJ-1500FX苏州净化设备厂高压灭菌锅DSX-280BSanyo公司，日本2.1.4 相关试剂配制(1)完全培养基：含10%血清，1%双抗(青霉素、链霉素)，用DMEM高糖培养基定容。(2)胰酶终止液：含10%血清，用DMEM高糖培养基定容。(3) DEPC水：500U1DEPC母液定容至11,通风橱过夜，二次高压灭菌。(4) 5TBE(I1)：Tris54g,硼酸27.5g,EDTA3.72g,灭菌后用DEPC水定容至I1o(5) 1%RNA电泳琼脂糖凝胶：1%琼脂糖，1XTBE定容。(

7、6) 50TAE(I1)：Tris242g,Na2EDTA2H2O37.2g,加入80Om1的去离子水，充分搅拌溶解后，加入57.1m1的醋酸，充分混匀，最后加去离子水定容至11,室温保存。(7) 1%DNA电泳琼脂糖凝胶：1%琼脂糖，用IXTAE定容。2.2实验方法2.2.1 细胞培养方法2.2.1.1 细胞冻存(1)细胞在培养瓶中培养至对数生长期，弃培养基后用2m1DPBS清洗，加入2m1胰酶消化约90s,待细胞变圆后，继续加入4m1终止液(含10%血清的DMEM培养基)终止消化。(2)吹打，使细胞悬浮，将悬浮液完全转移至15m1离心管中离心，(离心条件：室温25C,IOOOrpm,IOm

8、in),收集细胞。(3)离心后弃上清液，加入1.8m1冻存液(DMEM:血清:DMSO=5:4:1)吹打悬浮细胞后转移至冻存管，程序降温湿盒-8(C降温24h,于80冻存；或者冻存管置于4IOmin后，转移至20降温30min-2h,最后置于80冻存；20C不宜放置太久，易产生冰晶损伤细胞，30min2h冻存液冻结即可转移。2.2.1.2 细胞复苏取冻存细胞于37水浴中快速解冻(适当速度持续晃动冻存管)，解冻后悬浮细胞并转移至安剖瓶中，加入5m1完全培养基(含10%血清、1%抗生素)于培养箱中进行培养(培养箱条件：37、5%CO2)o每天观察，清洗死细胞，更换新鲜培养基，直至生长情况良好后传代

9、。2.2.1.3 细胞传代培养瓶中的细胞弃培养基后用2m1PBS清洗，加入2m1胰酶消化约90s,至细胞变圆后,继续加入4m1终止液（含10%血清的DMEM培养基）终止消化，完全转移至15m1离心管中（离心条件：室温25,1OOOrpm,1Omin）,离心收集细胞。离心后弃清液，加入2m1培养基吹打悬浮细胞后分瓶培养，每瓶加入5m1完全培养基于培养箱中进行培养。2.2.1.4 细胞计数将待计数的细胞悬液吹打均匀，用移液枪移取2001细胞悬液滴到细胞计数板的计数区，盖上盖玻片，不要有气泡，将制好的细胞装片放到荧光倒置显微镜下观察，计算出计数板四大格细胞总数，压线细胞只计算左侧和上方的。然后按下列

10、公式计算：细胞数m1=4大格细胞总数4x104稀释倍数。2.2.1.5 细胞药物处理弃培养基后用2m1PBS清洗，加入2m1胰酶消化约90s,至细胞基本变圆，继续加入4m1终止液（含10%血清的DMEM培养基）终止消化，完全转移至15m1离心管中，吹打混匀细胞后取2001细胞悬液在血细胞计数板上进行计数（计算公式:细胞数1=（4大格细胞数之和/4）x6x104）。离心（离心条件：室温25,1000-pm,10min）收集细胞。离心后弃上清液，根据接种量和计数结果加入适当体积的培养基悬浮混匀细胞接种到培养板中，补足培养基，于培养箱中进行培养，接种至细胞贴壁后更换含不同浓度药物的培养基培养。表2细

11、胞接种量细胞培养板接种量培养基（m1）6孔50万/孔224孔37.5万/孔196孔7万/孔0.22.3实验操作方法TYRTYRP1和TYRP2的基因转录受到MITF的调控。而MITF是黑色素细胞和黑色素瘤中的一种组织特定转录因子，对于黑色素细胞的增殖和黑色素的生成具有关键作用。本实验主要通过半定量PCR和qPCR比较经不同浓度异鼠李素处理后黑色素瘤细胞中TYR,TYRP-1TYRP-2,MF,GAPDH,ASP,MC1R等基因mRNA表达水平的差异。2.3.1 异鼠李素配制称取0.0095g异鼠李素用Im1I%NaOH溶解,再用完全培养基定容至30m1,配成ImM的异鼠李素溶液。依次用培养基稀

12、释配制成0.5、0.25、0.125、0.0625mM4个浓度。用0.22m针筒细菌滤器过滤。2.3.2 细胞培养将上述细胞株用含有10%胎牛血清的DEME完全培养基在37、体积分数为5%CO2、完全饱和湿度条件下常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱和状态时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，2天传代1次，实验选用对数生长期细胞。23.3细胞RNA的提取药物处理48h后取出6孔培养板，4PBS清洗后加入Im1TriZo1,冰浴裂解15min,转移液体到1.5m1离心管中，加入2001氯仿，剧烈震荡混匀30s,离心(4,12000rpm,15min)o离心后转移上层水相，加入等量异丙醇，涡旋震荡

13、15s,充分混匀后于4下静置沉淀RNA(30min)离心(4,12000rpm,15min)后小心移除上清，沉淀中加入7001无水乙醇，弹起RNA沉淀漂洗，离心(4,12000rpm,5min),重复洗涤2-3次后除尽乙醇，室温晾干RNA沉淀(约5min),加入501RNase-freeWater溶解，轻弹离心管混匀。微量分光光度计测定RNA浓度和纯度并进行RNA电泳(电泳条件：1%RNA琼脂糖凝胶；电泳缓冲液TBE；电压Io0V；电流100mA；时间45min-1h)鉴定。2.3.4 cDNA的制备反转录使用TransAT341-02反转录试剂盒，201反转录体系如下：组分体积Tota1RN

14、A1g(计算浓度稀释后加)5A11-in-0neSuperMix41gDNARemover11RNase-freeWaterUpto201轻轻混匀反转录反应体系后，于42C孵育15min,迅速转入85加热失活5s,置于-20C保存。2.3.5 半定量PCR引物序列(1) tyrosinase-250bpupstream5,-AACAATGTCCCAAGTACAGG-3downstream5,-TGACTCTTGGAGGTAGCTGT-3TRP-I-215bpupstream5,-GGCCTCTGAGGTTCTTTAAT-3downstream5,-AATGACAAATTGAGGGTGAG-3(

15、3) TRP-2-177bpupstream5,-ATGAGAAACTGCCAACCTTA-3downstream5,-AGGAGTGAGGCCAAGTTATGA-3(4) MITF-18Ibpupstream5,-AGTACAGGAGCTGGAGATG-3,downstream5,-GTGAGATCCAGAGTTGTCGT-3(5) GAPDH-223bpupstream5,-GTGAAGGTCGGTGTGAACG-3,downstream5,-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3(6) ASP-124bpupstream5,-ACAGGAGTCTGCGGAGTAAC-3,downstream5,-GAAGACCTCTTCCGCTTCTCG-3,(7) MC1R-I26bpupstream5,-ACCAACCAGTCAGAGCCTTG-3downstream5,-CAGGTTGCGGTTTTTGGTGA-3,3实验结果3.11普通PCR检测特征片段对提取的黑色素瘤细胞RNA